流式细胞术在农业研究领域中的应用

王 蕾，罗帝洲，邓紫璇,，莫敏莹,，张健玲，苏颖辉，房元杰，张晓爱

（1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保护与利用重点实验室，广东 广州 510640；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；3.江门海关技术中心，广东 江门 529085）

流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是一种单细胞分析技术，基于流式细胞仪通过检测散射或偶联荧光信号快速、准确、客观、高通量获得悬浮微粒（通常是细胞、细菌等微小颗粒）一系列重要的生物物理、生物化学相关特征参量，并能根据预选的参量范围对细胞、细菌等微小颗粒进行自动分析和对特定群体进行分选。流式细胞术是20 世纪60 年代后期开始发展起来的。20 世纪50 年代，光电粒子计数器被发明出来；1967年，Kamemtsky 和Melamed 提出细胞分选的方法；两年后Van Dila Fulwyler 及其同事发明了第一台荧光检测细胞计［1］。从早期使用的显微镜技术、激光共聚焦显微成像技术，到现在广泛应用的计算机图像处理与分析系统，光学与电子电路等现代仪器已成为科学研究中必不可少的重要组成部分。国内外专家和学者在光学和电子信息技术研究方面展开了更多的探索，使流式细胞仪的研究开始朝模块化方向迈进。

流式细胞术应用于许多研究领域，特别是生物技术和医学领域。近年来，由于流式细胞仪性能不断提高、检测快速以及高质量试剂不断开发，流式细胞术在农业研究领域中的应用也越来越广泛。就植物研究而言，由于植物细胞的特殊结构——细胞壁的作用，使流式细胞仪在植物中的应用受到限制。但是近年随着分子生物学及生物信息学等学科的不断发展，流式细胞学方法被广泛应用于植物病原菌的分类与定位、基因组测序以及基因表达谱分析等诸多方面，如倍型分析、DNA 含量分析、原生质体分选、细胞周期分析、细胞融合产物分选等。就畜牧研究而言，流式细胞仪在疫病检测、精子分选和性别控制等方面也有广泛应用。随着分子生物学的发展以及计算机技术的进步，流式细胞术已经能够对生物样品进行快速准确的分析处理，并实现高通量筛选。流式细胞术虽在微生物研究中应用较晚，但是也得到一定程度的发展，目前已经发展了多种基于流式细胞术对病原菌进行快速筛查以及分离纯化的方法。随着流式细胞术越来越完善，在农业中的应用越来越广泛和深入，该技术为农业科学研究提供了更强大的技术手段。

1 流式细胞术原理和功能分类

1.1 流式细胞术原理

流式细胞术是在流式细胞仪的基础上，利用激光作为光源激发悬浮微细胞、细菌等微小颗粒的荧光分子，产生散射光和荧光信号。这些信号被光电二极管或光电倍增管等检测器读取后，聚焦激光和荧光信号的光学元件阵列与光散射特征相结合，从而对悬浮液中的细胞或颗粒进行详细分析［2］。流式细胞术可以快速测量、存贮、显示在一定压力下悬浮于液体中呈分散状的细胞、细菌等微小颗粒，利用分析细胞或颗粒的光散射特性以及靶向抗体或细胞探针的荧光信号反映细胞或颗粒的特性，并且可以同时测量多个参数，根据预先选择的参数范围对特定亚群的细胞进行分类和分选［3］。

流式细胞仪主要由激光源和光学系统、流动室和液体流动系统、光电管和检测系统以及计算机和分析系统4 个部件构成。流式细胞仪有3 个重要的基本常数，即前向角散射、侧向角散射和其他参数。其中，前向角散射可用于检测不同大小的生物细胞和微粒；侧向角散射通常用来反映生物细胞和微粒的表面形态、分布形态以及生物细胞内颗粒的大小，也可精确地了解生物细胞内的微观结构等参数［4］；其他参数通常为利用荧光光源的强度来检测待测物质在生物细胞内的量和位置等。

1.2 流式细胞仪功能分类

1.2.1 分析型流式细胞仪 分析型流式细胞仪只能用于流式分析，细胞通过液体流动系统进行分析，最后进入废液桶而无法再循环使用［5-6］。流式细胞仪的检测和分析能迅速、高通量分析个体细胞中是否有大量的荧光和光散射信号，这些信号与细胞形态、细胞表面和细胞内蛋白的表达、基因表达和细胞生理有关，最终得到样本群中的细胞理化特性，从而能够对复杂体系中的样品进行精确的定量分析和影像分析［7］。

1.2.2 分选型流式细胞仪 分选型流式细胞仪除含有分析型流式细胞仪的系统外，还配备了分选模块，可同时进行数据采集和细胞分类分选。分选型流式细胞仪通过在喷嘴上引入轻微振动，当射流从喷嘴出来时，在射流表面上产生小波，使其在激光交叉点下游破裂成规则的液滴，从而能够将样本中的靶向细胞进行分离和回收。分选不会对被处理的微粒造成损害，也不会对细胞的活性和功能产生任何影响，因此可用于后续的功能性实验［8-9］。

2 流式细胞术在农作物研究中的应用

2.1 农作物种质资源基因组分析

流式细胞术在植物研究中最重要的应用之一是细胞核DNA 含量的测定，通过分析可以得出目标植物的基因组大小、细胞周期、遗传倍性水平，以及对目标细胞核进行精准分选等［10-15］。张俊环等［16］应用流式细胞术对普通杏、辽杏、西伯利亚杏、紫杏和仁用杏5 个种或类型的13 个杏品种资源的基因组大小进行测定，首次揭示了杏属植物不同种和品种间基因组大小存在差异，为后续杏基因组大小与其种间分化、表型性状及植物学分类研究奠定基础。李雯雯等［17］利用流式细胞术鉴定新疆野杏染色体倍性和DNA 含量，所采集的野杏均为二倍体，同时筛选出最适合杏的解离液。流式细胞术在种质资源鉴定中扮演着重要角色［18］。Burson 等［19］利用流式细胞术测定了568 份黄樟草种质资源，研究结果表明，黄樟草存在多种不同的倍性，明确了不同黄樟草种质资源内在的差异，也为黄樟草的开发利用以及种质创新提供理论依据。

2.2 植物原生质体分析与单细胞测序

植物原生质体在很多研究中被认为是完整植物细胞的理想模型，其包含完整的细胞结构，可用于研究植物细胞结构、生理功能和次生代谢产物等。可应用流式细胞术分析和分选目标原生质体进行后续的培养，对开展原生质体研究相关工作均具有重要意义。Luria 等［20］使用活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）探针测定拟南芥和番茄成熟花粉的萌发频率，发现高ROS 花粉的萌发频率是低ROS 花粉的35 倍，同时证明使用流式细胞术研究花粉应激反应期间的代谢变化具有很好的潜力。随着科研方法和技术手段的进步，近年来单细胞测序技术在微生物学、筛选动物细胞单克隆等领域都有广泛应用［21］。植物细胞单细胞测序在很大程度上依赖流式细胞仪对样品进行分离纯化得到原生质体［22］。为获得玉米穗的单细胞转录组图谱，Xu 等［23］应用流式细胞仪获得纯化后的玉米穗原生质体并进行单细胞测序。Dreissig 等［24］利用流式细胞仪进行单细胞分选研究大麦花粉，评估每条染色体上的重组位点数量和位置，验证了细胞学假设。

2.3 农作物抗逆研究

植物在自然界不同生境中需要应对各式各样的环境胁迫，包括高温、低温、土地盐碱化、干旱、病虫害和环境污染等。一般植物可通过自身强大的抗逆能力调节基因表达，如合成抗冻蛋白、渗透调节蛋白等抗逆蛋白质［25］。目前有关植物内在抗逆调节的分子机制尚不清晰。利用流式细胞仪在检测方面的强大功能，选择合适的荧光染料与抗逆因子或抗病因子相结合，从而检测出抗逆基因表达的潜在途径［26］。同时流式细胞仪也可应用于植物病原微生物的检测，主要是利用特异性抗体识别病原体，通过测定特异的荧光表达量或者代谢产物等评估病原菌的生存能力或活力［27］。

3 流式细胞术在畜牧研究中的应用

3.1 动物免疫检测分析

流式细胞术在动物免疫检测分析，尤其是免疫细胞表面标志物检测和细胞因子检测方面应用也很广泛［28］。杨蕾芳等［29］利用流式细胞术检测小鼠感染附红细胞后细胞因子CD4、IL-17 等的表达变化，结果表明Th17 细胞在小鼠感染附红细胞后增多，由此推测此过程中Th17 细胞发挥一定的免疫调节。流式细胞术也可用于快速分析异质细胞群，可以从混合物中识别多个表型亚群，选择单个细胞，甚至可以分离该细胞用于表征免疫细胞和免疫相关疾病。有研究者使用流式细胞术比较荷尔斯泰因奶牛和荷尔斯泰因小牛之间以及荷斯坦奶牛分娩前后的外周血白细胞，发现与成熟奶牛相比，小牛白细胞的CD3 淋巴细胞、γδ T 细胞、CD8+γδT 细胞和单核细胞的比例更高。相反，奶牛淋巴细胞的CD4 和CD8 T 细胞以及B 细胞的比例高于小牛淋巴细胞，利用该技术可以更好地了解牛的免疫系统以及影响奶牛免疫的相关疾病［30］。因此，通过流式细胞术对动物淋巴细胞各亚群的数量进行测定，可监控动物的免疫状态并及时制定预防机制，避免各种传染病的传播。

3.2 动物机体微量元素检测

微量元素是动物必需的营养元素，直接参与机体大量的生理、生化活动，对动物的新陈代谢、生长发育及生产性能影响较大。研究微量元素对畜禽生产性能的影响，对提高微量元素的利用率、减少排放和控制环境污染具有重要意义。流式细胞仪对于动物体内的微量元素的检测具有重要作用。彭西等［31］利用流式细胞术研究日粮中硒对雏鸡免疫功能影响的机理发现，日粮硒水平达到5 mg/kg 以上会导致免疫器官细胞分裂增殖能力下降、凋亡细胞增多；外周血T 淋巴细胞增殖能力降低，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T 细胞数量下降，进而导致免疫器官生长发育受阻，出现病理损伤，严重影响其生长发育。Wu 等［32］通过流式细胞术等方法揭示了硒对黄曲霉毒素诱导的肉鸡肝脏发病具有保护作用，并揭示了黄曲霉毒素在细胞和分子水平上诱导细胞凋亡的机制，流式细胞凋亡分析结果显示，0.4 mg/kg 硒能改善afb1 诱导的肝脏细胞凋亡。Fasil 等［33］采用流式细胞术定量测定斑马鱼细胞内ROS 的水平，分析探讨硒纳米颗粒（SeNPs）和氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）对斑马鱼体内ROS 产生的影响，细胞内ROS 流式细胞术分析显示，在不同浓度SeNPs+ZnONPs（2 mg/kg）联合处理和对照的斑马鱼中，SeNPs+ZnONPs 联合给药比单独给药产生的ROS 更少。

3.3 精子质量控制和性别控制

流式细胞术可以用于动物精子质量控制和动物性别控制方面的研究。利用流式细胞术可以对精子类型进行选择，产生符合期望的性别后代，从而促进畜牧业发展。哺乳动物（家畜）中的后代性别主要由父本的X/Y 染色体决定，X 精子的DNA 含量比Y 精子多3.0%～4.5%，据此可以利用流式细胞术对哺乳动物的精子进行分离，获得高纯度的X、Y 精子群，从而达到控制动物性别的目的。该方法具有分离速度快、准确性高的特点，克服了传统方法对精子活力、胚胎和后代发育造成损伤的缺点［34］。研究表明，利用流式细胞术分离精子，可以达到8 000 个/s 的分离速度，纯度可达到90%左右。目前流式细胞术已在生产上应用于各种哺乳动物的精子分离，包括牛、猪、马、绵羊、山羊、狗、猫、鹿、麋鹿、海豚、水牛等［35］。该技术的产业化应用对畜牧业育种具有重要意义。

3.4 霉菌毒素毒性作用分析

霉菌毒素对畜牧业是一种非常严重的危害［36-38］，一方面带来巨大的经济损失，另一方面严重危害人畜健康。由于流式细胞术具有快速、准确的特点，已被广泛应用于霉菌毒素检测及细胞毒性研究中。流式细胞术可以用于计数细胞以及检测细胞增殖情况，通过特定的染料还可以用于监测细胞的生理状态。目前已研制出多种染色剂来评价细胞功能，比如细胞繁殖能力、代谢活动、膜活动以及膜电位等。随着DNA 染料的不断发展、细胞周期阶段标记物的发现以及新技术的出现，流式细胞术一直是细胞周期和细胞凋亡研究的首选技术。因此，可以通过检测各细胞周期中DNA 含量的改变，得到不同时期细胞的分布比例，从而研究霉菌毒素对细胞增殖和细胞周期的影响［39-40］。Kwon 等［41］利用流式细胞术分析EGR-1 基因敲除对霉菌毒素诱导细胞凋亡的影响，结果表明，毒素通过增加氧化应激诱导转录因子EGR-1 的磷酸化而提高ATF3 的表达，进而导致细胞周期停滞和凋亡蛋白级联反应的激活。Fraeyman 等［42］利用流式细胞术对镰刀菌毒素等进行分析，通过检测IPEC-J2 细胞活力、凋亡、凋亡/坏死的百分比分布来评估真菌毒素对IPEC-J2 细胞的相对细胞毒性影响。流式细胞术不仅可以对细胞凋亡进行定性和定量检测，还能够根据细胞DNA 含量变化、线粒体膜电位和通透性的变化以及胞内ROS 等指标对细胞进行高通量分选，为霉菌毒素毒性作用分析提供了有力依据。

4 流式细胞术在农业病原微生物研究中的应用

4.1 病原菌分析

流式细胞术已被用于快速区分和鉴定微生物细胞、快速评估细胞活力和多种生理特性、分析抗微生物药物-细胞相互作用、分离高产菌株等，并已成功用于多种病例。对于菌血症、细菌尿症等病症，利用流式细胞术既能快速发现导致感染的微生物，又能根据细胞计数特征初步判断微生物种类。流式细胞术可以快速采集样品中细胞群的多种参数，能够从不同样品中检测和分离病原体的抗体和RNA 探针，并从样品基质中回收和区分细菌，区分总种群中的活细菌、受损或死亡的细菌细胞。使用特定的荧光染料还可以更深入地了解活细菌细胞的生理状态和代谢活动［43］。在厌氧条件下使用流式细胞术和细胞分选技术，能够从粪便材料中检测、分离和培养新的肠道共生菌种菌株。该方法可以快速分析微生物种群，同时可以使用特异性抗体对极度氧敏（Extremely Oxygen Sensitive，EOS）菌进行分类、分离和培养新的普氏菌和细枝杆菌菌株，为培养组学开辟了新途径［44］。另外，流式细胞术可以准确区分细胞外细菌和细胞内细菌，对于阐明病原体触发的宿主细胞侵袭的分子机制具有重要意义［45］。流式细胞术在食源性病原体检测中的应用也很广泛。Wang 等［46］基于流式细胞术，通过对特异性抗体进行荧光标记可快速和多重检测牛肉样品中的食源性病原体如沙门氏菌、大肠杆菌O157 和福氏链球菌的单细胞。Liu 等［47］通过高选择性的荧光标记抗体和碘化丙啶识别活的金黄色葡萄球菌细胞，再通过流式细胞术进行分析，可以有效监测金黄色葡萄球菌污染，可应用于快速检测牛奶和乳制品中的微生物。

4.2 病毒分析

病毒可以利用宿主因子进入细胞并引起疾病。研究病毒的入侵和复制阶段以及它们与宿主因素的相互作用是全面了解病毒感染的关键，对病毒性疾病的基础研究以及抗病毒产品在农业中的应用至关重要［48］。流式细胞术可用于分析病毒与细胞之间的相互作用，可以检测感染细胞内和表面的病毒抗原。通过使用特异性识别细胞表面或细胞内抗原的单克隆抗体，利用流式细胞术可以快速检测并定量受感染细胞，该技术现已用于诊断一系列病毒，包括导致流感［49］、鸡新城疫［50］、非洲猪瘟［51］和牛结核病［52］等的病毒。流式细胞术还可用于记录受病毒感染植物细胞间层面的感染状态，能够精准测量植物细胞被单种病毒或多种病毒感染的情况，以及受多种病毒变体感染的细胞在时空上的分布。Tromas 等［53］利用流式细胞术分析烟草花叶病毒的细胞感染速率。流式细胞术已被用于表征细胞群并检查其内部分子和过程，通常用于研究整个感染细胞内的病毒标记物。流式细胞术不仅用于检测还可用于纯化细胞内病毒的成熟中间体，这为病毒学研究衣壳组装、成熟和释放、分析突变表型以及确定与特定病毒中间体相关的宿主因子开辟了新的研究途径［54］。流式细胞术还可以应用于病毒核酸样本的测序［55］和病毒滴度的定量检测［56］，在病毒培养过程中监测病毒滴度和细胞系的状态对于开展疫苗生产及其优化非常重要。Schulze-Horsel等［57］认为，流式细胞术是研究培养条件和工艺变化对病毒复制和病毒产量影响的有价值的工具，对监测生物反应器病毒感染以及对于疫苗生产过程中的工艺表征和再现性研究也是灵敏、可靠的方法。

5 展望

流式细胞术是目前对单个细胞进行综合和多重分析最有效可行的技术，具有非常广泛的应用前景。随着光电技术的进一步发展，流式细胞仪已开始向模块化发展，即其光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照实验要求随意更换。随着新型多功能流式细胞仪以及新型特异探针的开发，流式细胞术的功能也将更强大、数据也将更精确；流式细胞术对小颗粒的检测能力也越来越强，打破了传统检测 0.5～50 μm 的颗粒检测范围，目前可以达到0.1 μm 的检测精度，极大拓宽其应用范围，使其还可应用于微囊泡（外泌体）的分析与分选、细菌和微生物研究等方面。目前流式细胞术在植物研究中的应用主要集中在细胞核DNA 含量的测定，在线粒体、叶绿体、花粉等应用研究较少。由于植物的细胞结构与组成存在多样性和复杂性，很大程度上限制了流式细胞术在植物研究中的应用。如何能够分离纯化出适合流式细胞仪分析和分选的单细胞颗粒悬浮液，是未来植物流式细胞术应用的关键前提。流式细胞仪在动物疫病检测、精子分选和性别控制等方面已被广泛应用。随着分子生物学的进一步发展以及计算机技术的进步，流式细胞术已经能够对生物样品进行快速准确的分析处理并实现高通量筛选。流式细胞术虽在微生物研究中开始得比较晚，但目前已经发展了多种对病原菌进行快速筛查以及分离纯化的方法，在病毒感染分析与诊断方面，具有特异性好、灵敏度高、操作能实现自动化等优点，应用前景广阔。

此外，单细胞测序方法（Single Cell Sequencing，SNS）可以准确定量单个细胞的基因组，能够避免混合样本的均质化掩盖单细胞的异质性，可以在单细胞水平下深入探索细胞状态，因此被评为2014 年度 Nature Methods 最重要的方法学进展。但是单细胞研究有两大技术难点，即对单细胞的精准捕获、对低丰度单细胞核酸高分辨率的测序，而流式细胞术能够在短时间内分析大量细胞，并且进行单细胞分选，将单个细胞的基因转录、蛋白表达和细胞功能三者有机结合，与上下游进行无缝衔接，流式细胞术已经成为单细胞获取的主流技术，具有成熟的标准操作方案。随着纯化技术和标记荧光染料的不断开发与完善，流式细胞术结合单细胞测序技术必将有广泛的应用前景。综上所述，流式细胞术由于其诸多优势，其应用前景将越来越广阔，在农业领域中也会发挥越来越重要的作用。