DNMT3b在膀胱癌组织中的表达及与经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的相关性

武海波 李 磊 谷泉霖

(ThePracticalJournalofCancer,2023,38:0025～0028)

膀胱癌作为常见的泌尿外科肿瘤，浅表性膀胱癌占大多数，临床上治疗膀胱癌的首选手段为手术治疗，其中经尿道膀胱肿瘤电切术最为常见[1-2]。有研究显示，经该手术治疗的患者术后存在较高的复发率，因此在术前明确易导致膀胱癌患者术后复发的相关原因并及时干预是降低其术后复发及改善预后的关键措施[3-4]。DNA 甲基转移酶DNMT3b 是 DNA 甲基化的酶促参与者，作为DNA甲基转移酶，DNMT3B已经通过调节基因的启动子用于增殖、迁移和侵袭[5-6]。重要的甲基化参与肿瘤进展，例如，DNMT3B 介导的转移抑制因子 1 (MTSS1)启动子的甲基化在表观遗传上抑制了膀胱尿路上皮癌中的 MTSS1 转录[7-8]。因此本研究检测了DNMT3b在膀胱癌组织中的表达，并分析其与经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的相关性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年4月至2018年4月本院收治膀胱癌患者82例，年龄42～79岁，平均(67.37 ±7.68)岁。纳入标准：①符合膀胱癌的临床标准[9]，经临床确诊为膀胱癌；②经尿道膀胱肿瘤电切术治疗；③患者签署自愿受试同意书，患者及其家属需签署知情同意书。排除标准：①精神疾病患者；②合并其他恶性肿瘤患者；③合并其他器官严重性病变患者；④临床病历及随访资料不完整或缺乏准确性。

1.2 免疫组织化学染色

使用10%甲醛溶液固定膀胱癌组织，经石蜡包埋后制备4 μm厚切片。切片烘烤后分别用二甲苯、酒精脱蜡、脱水；自来水冲洗后用H2O2溶液浸泡10 min以灭活内源过氧化物酶，PBS溶液冲洗3次；切片在柠檬酸盐缓冲液中加热15 min修复抗原，PBS溶液冲洗切片3次；甩干后滴加0.25%牛血清蛋白，室温孵育30 min；分别加CCL2、CDCA5抗体，4 ℃孵育14 h；复温90 min、PBS清洗后加生物素标记的二抗，38 ℃环境下孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min； DAB显色剂染色，5 min后冲洗进行苏木精复染1 min，冲洗、脱水后二甲苯固定，风干后封片。具体操作按照免疫组化染色试剂盒说明书进行。置于显微镜下观察，并采集图像资料。每张切片随机选取5个高倍镜视野进行阳性细胞计数。经免疫组化染色，细胞质呈棕黄色或棕褐色的细胞为阳性细胞。染色结果评分标准：按照染色强度和阳性细胞所占百分比记分。①染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②阳性细胞所占百分比： <5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两者记分相乘，≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。

1.3 收集临床资料以及随访资料

收集患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤最大径等临床资料。采用电话及门诊或住院复查等方式进行3年随访，了解患者生存情况。随访时间截止2021年5月，根据随访结果将患者分为复发组和未复发组。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 膀胱癌组织中DNMT3b表达及与患者的临床病理特征的关系

82例膀胱癌组织中DNMT3b阳性表达57例(69.5%)。DNMT3b表达与TNM分期、T分期、肿瘤最大直径、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

2.2 影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的单因素分析

经尿道膀胱肿瘤电切术后复发14例。DNMT3b表达阳性、TNM分期越高膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发率均显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的单因素分析/例

2.3 影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发多因素logistic分析

多因素logistic 回归分析显示，DNMT3b表达、TNM分期均为影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的独立危险因素(P<0.05)， 见表3。

表3 影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的多因素logistic分析

3 讨论

膀胱癌是一种发生于膀胱黏膜的恶性肿瘤，是世界范围内第10位最常见的癌症类型[10]。据全球癌症统计，2018年膀胱癌新发病例约54.9万例，死亡20万例[11]。膀胱癌不仅影响泌尿系统的功能，而且容易复发和转移[12]。目前临床上所有实体肿瘤治疗中，膀胱癌患者术后复发率最高，因此术后复发成为了评估膀胱癌患者术后预后的重要性指标[13]。研究报道称影响膀胱癌患者术后复发的因素有很多，如致癌物质的持续接触和刺激以及手术治疗不彻底等，但是具体因素还尚不清楚[14-15]。

DNA甲基化，即由DNA甲基转移酶(DNMT)催化的甲基向DNA分子的转移，几乎只发生在哺乳动物的CpG岛中[16-17]。非CpG甲基化发生在胚胎干细胞中，最近在人类B细胞分化过程中观察到[18]。DNMT家族包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1已被证明在体细胞中维持甲基化，并且DNMT3a和DNMT3b被认为参与胚胎干细胞和早期胚胎的DNA从头甲基化[19-20]。最近发现，与相应的正常组织相比，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在几种人类肿瘤中过表达[21]。DNMT3b基因在膀胱癌组织中存在过表达，参与了膀胱癌的发生发展[22]。本研究中DNMT3b与TNM分期、T分期、肿瘤最大直径、淋巴结转移有关。DNMT3b表达阳性膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发率更高。提示DNMT3b蛋白是经尿道膀胱肿瘤电切术后膀胱癌复发的危险因子。有研究显示临床分期是膀胱癌患者术后复发的预测因素，且分期越高，其复发的可能性越大[23]。本研究中TNM分期越高膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发率也越高，这与既往研究一致。本研究中DNMT3b表达、TNM分期均为影响膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的独立危险因素，提示DNMT3b表达、TNM分期可作为预测膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后复发的指标。

综上所述， 经尿道膀胱肿瘤电切术治疗的膀胱癌患者术后存在一定的复发性，DNMT3b表达、TNM分期是导致膀胱癌患者术后复发的独立危险因素。但本研究规模较小，未进行深入研究，在今后的研究中还需要扩大样本量以及研究范围，完善实验结果，确保其准确性，为新的预测指标应用于临床提供参考依据。