自体脂肪来源血管基质组分治疗膝关节骨关节炎的临床研究

李 宝，金文铭，李 涵，向杜磊，赵 根，沈 阳，刘欣伟，邵 兵 (1.中国医科大学北部战区总医院研究生联合培养基地，辽宁 沈阳 110016；.北部战区总医院骨科/全军重症战创伤救治中心，辽宁 沈阳 110016；3.锦州医科大学北部战区总医院研究生联合培养基地，辽宁 沈阳 110016；4.大连医科大学北部战区总医院研究生联合培养基地，辽宁 沈阳 110016)

骨关节炎是当今世界致残率极高的慢性疾病之一，在全身各大关节中均可发生，临床上以膝关节骨关节炎最为常见，严重影响患者的生活质量[1]。骨关节炎的发生与年龄、性别、遗传、BMI、代谢等因素相关，骨关节炎造成的软骨慢性损伤几乎不可逆[2-4]。骨关节炎诊疗指南(2018年版)显示，我国膝关节症状性骨关节炎的患病率高达8.1%，对中老年人的影响最为严重[5]，临床表现早期以关节疼痛、肿胀为主，若不及时有效处理晚期可发生关节间隙狭窄、活动受限甚至畸形，严重影响患者的日常行动能力。骨关节炎可通过结合患者的临床体征表现和典型影像学表现确诊，早期骨关节炎患者可通过口服营养软骨类药物(如氨基葡萄糖)和非甾体类抗炎药物对症治疗来延缓骨关节炎进展，但疗效并不理想；晚期骨关节炎患者需接受关节置换手术，但即使进行关节置换，术后疼痛发生率仍高达40%[6]。因此，目前针对骨关节炎尚无确切有效的治疗方法。近年来，干细胞应用于骨关节炎的治疗逐渐成为研究热点，国内外许多研究证实了各种来源(包括脐带血来源、骨髓来源、胎盘来源等)的间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性，干细胞在骨关节炎的治疗上展现出较大潜力[7-8]。自体脂肪来源血管基质组分(stromal vascular fraction，SVF)来源于自体脂肪组织，其含有多种具有修复功能的细胞及相关因子，具有一定的多向分化能力，可以修补缺损的软骨组织，进而达到治疗骨关节炎的目的[9]。但目前关于SVF应用于治疗膝关节骨关节炎的临床疗效尚不明确[10-11]。因此，本研究通过探讨SVF治疗膝关节骨关节炎的临床疗效，为膝关节骨关节炎的临床治疗提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年1月至2020年1月北部战区总医院收治的膝关节骨关节炎患者48例，按照随机数字表法将其分为观察组(自体脂肪来源SVF关节腔内注射)和对照组(玻璃酸钠关节腔内注射)，每组24例。2组患者基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。纳入标准：①X射线影像学Kellgren-Lawrence(K/L)分级为Ⅲ级及以下；②年龄>45岁；③无髋关节、踝关节病变；④近6个月未注射膝关节炎治疗药物；⑤双侧膝关节受累。排除标准：①膝关节有严重外伤和/或手术史；②伴其他类型的继发性关节炎、自身免疫疾病。本研究由北部战区总医院骨科运动医学联合瑞思坦生物科技有限公司共同进行，已通过北部战区总医院伦理委员会审批[Y(2021)027号]，所有患者均签署知情同意书。

表1 患者基线资料比较(n=24)

1.2 脂肪组织获取

所有患者均从腹部抽取脂肪组织，采用全身麻醉，常规消毒铺巾，于脐下1 cm作1个直径约0.3 cm的水平切口，20 mL注射器连接直径为1 mm的注水针用于注射膨胀液，每侧以放射状均匀推注膨胀液[0.9%氯化钠溶液500 mL+利多卡因(5 mL∶0.1 g)5支+碳酸氢钠(10 mL∶0.5 g)半支+肾上腺素(1 mL∶1 mg)半支+地塞米松(1 mL∶5 mg)1支]约60 mL，推注后等待 5～10 min，直至整个手术区域膨胀达到预期效果以便进行抽吸操作。连接负压注射器的三孔钝头吸脂针，经切口刺入腹部皮下脂肪，吸脂范围上至肋下缘连线，下至髂嵴水平，两侧至腋中线，以切口为中心，两侧呈扇形，均匀吸取脂肪组织60 mL后，缝合并包扎切口，使用弹力腹带于腹部加压，术毕。抽取的脂肪在注射器中垂直倒置片刻使其和膨胀液、血液相分层,以便获取纯度更高的脂肪组织，推出注射器内下层液体，将脂肪组织推入标本瓶，放入冷链运输箱中运至实验室提取干细胞。

1.3 SVF提取

首先使用PBS对脂肪组织清洗3～4次，清洗后过滤除去缓冲液，缓冲液中加入消化提取试剂(0.1%～1% W/W胶原酶溶液、2%～10% W/W海藻糖溶液和0.05%～0.15% W/W明胶溶液)，在35 ℃环境下充分震荡并消化30～60 min，然后以900～1 400 r/min离心去除上层油脂、提取液和血细胞，加入生理盐水洗涤并沉淀细胞，以900～1 400 r/min进一步离心5 min去除上清液，再次沉淀细胞后加入8～10倍体积量的生理盐水重悬细胞，80～120 μm过滤器过滤后得到SVF细胞，然后再次离心、重悬、过滤，最终得到纯度较高的SVF细胞。无菌环境下将提取到的约4 mL SVF试剂均分至2支 5 mL注射器中，无菌包装后放置于冷链运输箱准备注射。

1.4 关节注射

观察组自体脂肪来源SVF关节腔内注射均在病房完成，患者取平卧位，双膝关节放松伸直，穿刺位点选在髌周，在髌骨外侧缘、上缘各作1条与肢体长轴相平行和垂直的线，两线相交的点作为注射穿刺点。消毒铺巾后，使用2 mL 1%利多卡因局部浸润麻醉，穿刺针和髌骨平面成斜45°角，针尖刺向髌骨下，将2 mL SVF制剂注入关节腔内，对侧膝关节注射过程同上[12-13]。对照组注射玻璃酸钠，每次1支，每周1次，连续5周，注射具体流程同观察组。注射用玻璃酸钠试剂(2.5 mL)每支含玻璃酸钠25 mg(华熙生物科技股份有限公司)。

1.5 术后处理

2组注射后1 h内鼓励患者进行膝关节的伸直与屈曲活动，以使试剂在关节腔内充分扩散，术后24 h不限制膝关节负重，可恢复日常活动。对于疼痛明显的患者可口服非甾体类抗炎药物镇痛[14-15]。

1.6 观察指标

通过门诊复查或电话随访，比较2组患者术前及术后3、6、12、18个月膝关节WOMAC评分、Lysholm评分、视觉模拟量表(visual analogue scale，VAS)评分及术后相关不良反应(包括注射后关节疼痛、肿胀、发热、感染等)的发生情况。末次随访时，患者进行核磁共振检查，记录半月板及软骨损伤信号改善情况。WOMAC评分按照疼痛、僵硬、功能三个方面评估，满分240分，总分80分以下为轻度骨关节炎，80～120分为中度，120分以上为重度，分数越低越优；Lysholm评分包括跛行、肿胀、疼痛、稳定性、绞锁等，满分100分，95分及以上为优秀，85～94分为良好，65～84分为尚可，65分以下为差，分数越高代表膝关节功能越好；VAS评分满分10分，0分代表无痛，10分代表极度疼痛，分数越低越优。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 患者WOMAC评分、Lysholm评分、VAS评分比较

本研究纳入的48例患者有45例完成随访，平均随访(19.2±0.9)个月，3例患者中途失访(观察组1例，对照组2例)。2组患者术前及术后3个月WOMAC评分、Lysholm评分比较差异无统计学意义(P>0.05)；术后6、12、18个月观察组的WOMAC评分、Lysholm评分优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组患者术前及术后3、6、12个月VAS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)；术后18个月观察组的VAS评分低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 患者WOMAC评分、Lysholm评分、VAS评分比较分)

2.2 影像学变化

患者于末次随访时进行核磁共振检查，观察组中患者的影像学检查显示半月板及软骨损伤信号较治疗前改善明显(图1)；而对照组患者末次随访时影像学检查未见损伤信号改善(图2)。

a：术前见半月板及软骨损伤信号；b：末次随访见损伤信号改善

a：术前见半月板及软骨损伤信号;b：末次随访未见损伤信号改善

2.3 患者不良反应发生情况

观察组术后出现1例关节疼痛加重，1例发热；对照组出现1例发热，1例关节肿胀，发热、关节疼痛加重和肿胀等情况均于术后1周内自行缓解。2组患者随访期间均未出现感染等严重不良反应。2组患者不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 患者术后不良反应发生情况比较[例(%)]

3 讨论

关节软骨本身无血管神经支配或营养，也不与周围血管相接触，软骨细胞属永久细胞，一旦分化成熟，几乎没有再生能力[16-17]。因此，原发或继发原因导致的软骨损伤无法通过软骨再生来修复。软骨损伤所导致的骨关节炎的治疗一直是临床较为棘手的问题，其发生、发展与年龄、性别、BMI等因素存在一定的相关性，但原发性骨关节炎的发生机制目前尚不明确，运动医学和康复医生认为控制BMI进而减少体质量对膝关节的压力是延缓骨关节炎进展的有效手段，对于存在主观症状者则建议口服或外用药物对症治疗。逆转骨关节炎病情或使其达到临床治愈仍是医学难题。近年来，随着干细胞领域的拓展，其在骨关节炎治疗中的应用逐渐被关注，且应用前景良好，利用干细胞或其衍生物来治疗骨关节软骨损伤进而逆转骨关节炎成为可能[18-20]。

本研究中，观察组术后6、12、18个月WOMAC评分及Lysholm评分均优于对照组，且观察组患者的手术前后影像学表现可观察到软骨损伤信号的改善，而对照组并未观察到软骨损伤信号的改善。这是因为相比于对照组，观察组注射制剂中含丰富的成脂前祖细胞、富血小板血浆和一定量的免疫调节因子，在改善损伤软骨周围微环境的同时，SVF中的祖细胞可在一定程度上分化、增殖为软骨细胞，起到填补缺损、修复软骨的作用，这与其他相关研究结果相同[21]，说明关节腔内注射SVF取得了更好的临床疗效。目前应用于治疗膝关节软骨损伤的干细胞来源众多，且都有相关报道证实了其有效性，但尚无研究对比各种干细胞的疗效，并且干细胞在此领域的研究时间相对较短，尚无研究报道远期是否有相关不良反应的发生。但可以确定的是，相比于其他来源的干细胞或制剂，SVF源于自体，几乎无排斥反应，异质性不明显，注射后未见严重不良事件的发生，同时对BMI较大的患者还能起到一定的减肥效果，因此SVF不失为一种治疗骨关节炎的良好选择方案。

本研究仍存在一些局限性：①样本量小，随访中存在失访数据，将影响最终结果的准确性及代表性；②VAS评分不够准确，部分患者于穿刺术后因疼痛需要服用镇痛药物，使得VAS评分在本研究中并未得到准确的评估，我们猜想2组术后3、6、12个月VAS评分比较差异无统计学意义与服用镇痛药物有一定的相关性，对此问题暂未提出改进方法；③无法使用盲法，在本研究中因SVF的获取需对患者本人进行全麻吸脂操作，患者对自己分组情况明确，安慰剂效应导致的偏倚无法避免。

本研究探讨了关节腔内注射SVF对骨关节炎治疗的有效性，经过至少18个月的随访获得了令人满意的临床疗效，随访期间可观察到膝关节功能评分均有不同程度的改善，且并未出现严重的不良反应，安全有效。但关于注射剂量和注射频率与最佳临床疗效之间的关系仍需要大样本、多中心的临床研究进一步明确。