铁皮石斛组培快繁技术

李得萍，何远秦，许丁帆，易元慧，董洪雨，刘艳军

(天津农学院 园艺园林学院，天津 300392)

铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)又称黑节草，是一种重要的药用草本植物，具有生津、降血糖、增强机体免疫力等作用，近年愈发受保健品市场的喜欢[1-3]。铁皮石斛种子细小，没有胚乳，必须与真菌共生才能萌发，因此，自然繁殖率低[4-5]。早期一般通过扦插、分株的繁殖方式进行铁皮石斛的生产繁殖[6]，这些常规方式存在繁殖周期长、速度慢等问题，不能满足生产中对铁皮石斛种苗的大量需求。而通过组织培养技术进行组培快繁可以极大的缩短繁殖时间，故使用组织培养技术来进行工厂化育苗是解决繁殖率低的理想手段[7]。同时也可通过人工种子技术进行铁皮石斛的繁殖[8-9]。

铁皮石斛组培中多采用种子播种[10-11]诱导原球茎进行组培快繁，而本研究采用了诱导铁皮石斛腋芽萌发的方法，通过不断剪切带芽茎段来进行诱导、增殖和生根。与传统的无菌播种快繁相比，本研究采用的方法有以下三点优势：首先是成苗的生长势较强，腋芽直接再生要比从原球茎长出的芽生长势强，可以直接用于生根，从而缩短了组培的时间；其次，腋芽萌发出来的芽的自然变异率要明显低于原球茎，从而保障了再生苗的遗传稳定性，使得组培体系更稳定；最后，此方式的成苗质量高，获得的再生苗在形态上与母本一样，高度保持了母本的特性。而通过传统方法以原球茎进行再生的苗中畸形苗较多，需要长时间的培养才能变成正常苗，进而影响铁皮石斛的商品价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用铁皮石斛盆栽苗由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 铁皮石斛外植体消毒

剪取长度为2～3 cm的铁皮石斛嫩芽，用70%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水冲洗30 s，再分别使用20%、30%、40%的次氯酸钠水溶液消毒，消毒时间设置为5、10、15、20 min，消毒后无菌水冲洗3次，每次冲洗10 min。最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分，将外植体接种到基础培养基(MS)上。试验重复3次，每个处理接10瓶，每瓶接种4个外植体。10 d后观察并统计不同处理的外植体污染率、死亡率。

1.2.2 铁皮石斛腋芽的诱导

将消毒处理后没有污染、生长健壮的铁皮石斛茎段外植体接种到含有不同激素的培养基上，诱导茎段腋芽萌发。培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度细胞分裂素(BA)、激动素(KT)和萘乙酸(NAA)，6种培养基分别为：①1.0 mg·L-1BA；②1.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；③2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；④1.0 mg·L-1KT；⑤1.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA；⑥2.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA。每个处理接种10瓶，每瓶接种4个外植体，试验重复3次。接种后每3 d观察1次，40 d后统计平均每个侧芽诱导系数与再生芽生长情况。

1.2.3 铁皮石斛腋芽增殖培养

将铁皮石斛茎段上诱导出的腋芽接种到含不同激素的培养基上进行增殖培养。培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度分裂素BA和生长素NAA、吲哚丁酸(IBA)，6种培养基分别为：①0.5 mg·L-1IBA；②0.5 mg·L-1IBA+1 mg·L-1BA；③1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA；④0.5 mg·L-1NAA；⑤0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA；⑥1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA。每个处理接种10瓶，每瓶接种4个外植体，每个处理重复3次。接种后每3 d观察1次，经过40 d后观察并统计平均每个侧芽增殖系数与丛生芽生长情况。

1.2.4 铁皮石斛的生根培养

将增殖培养中萌发的腋芽长到3～5 cm高时剪下，一部分继续用于增殖培养，另一部分进行生根培养。将用于生根培养的小苗接种到含有不同生长素的生根培养基上，培养基以MS为基本培养基，分别添加不同种类和不同浓度的生长素IAA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)和NAA(0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，每个处理接种10瓶，每瓶接种4个外植体，每个处理重复6次。接种后每5 d观察1次，30 d后观察并统计植株平均生根数、平均根长和生根质量以及植株生长情况。

1.2.5 培养条件

以上培养基均采用5.5 g·L-1琼脂粉，30 g·L-1蔗糖，pH 5.8～6.0，培养温度(25±2)℃，光照强度2 000～2 500 lx，连续照明。

1.2.6 数据统计及方法

腋芽诱导系数=诱导形成的腋芽数/接种茎段数；

增殖系数=有效芽数/接种外植体数(有效芽为芽高≥1 cm的芽)。

试验数据均采用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理方法对外植体消毒效果的影响

由表1可知，不同浓度的消毒剂和消毒时间对外植体消毒效果不同。在20%次氯酸钠消毒液作用下，外植体污染率一直是处于很高的水平，说明在低浓度消毒液下微生物基本不受影响，即使延长作用时间，也不能杀死植株体内的微生物。从外植体生长来看，在低浓度的消毒液作用下除了被微生物侵染造成的生长影响外，外植体没有出现受消毒液影响而褐变死亡的现象；在高浓度40%的次氯酸钠作用下，微生物几乎全被杀死，只有在消毒时间为5 min时有少数外植体出现污染现象，可能是由于消毒时间过短引起的，这说明在此浓度下，微生物不能够生存，但同时在这种较高浓度的消毒液水平下，几乎所有外植体都出现了褐变死亡现象，说明在高浓度的消毒液作用下植物材料不能够正常生长；当采用30%次氯酸钠消毒时间为10 min时，外植体污染率6%，死亡率0，在外植体污染率较低的前提下也能保证外植体的存活，消毒效果较好。综合考虑，最适的铁皮石斛茎段外植体消毒方法为：使用30%次氯酸钠水溶液，消毒10 min。

表1 不同消毒处理方法对铁皮石斛外植体消毒效果的影响

2.2 不同培养基对铁皮石斛茎段腋芽诱导培养的影响

由表2可知，采用不同激素的培养基对铁皮石斛茎段腋芽诱导的情况差异明显。在单独使用BA或KT时，虽然都能诱导出腋芽，但芽细弱、颜色淡绿，说明再生芽内源生长素含量较低，需要在培养基中添加外源激素；当添加NAA后，再生芽健壮，且诱导率高于单独添加分裂素BA或KT；当使用KT作为分裂素时，诱导出的芽细弱，诱导率不高，同时随着KT浓度的增加，再生芽出现玻璃化现象，说明KT不适宜铁皮石斛的生长。使用BA作为分裂素时，诱导出的再生芽生长正常，生长速度快，随着BA浓度的增加，诱导率也增大，当BA浓度为2.0 mg·L-1时，再生芽生长快且健壮，诱导率5.6。因此，选择MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA作为铁皮石斛茎段诱导腋芽的诱导培养基。

表2 不同培养基对铁皮石斛茎段腋芽诱导培养的影响

2.3 不同培养基对铁皮石斛丛生芽增殖培养的影响

由表3可知，不同激素的培养基对铁皮石斛丛生芽增殖情况差异明显。在单独使用生长素IBA或NAA时，虽然都有一定的增殖，但增殖率不高，且丛生芽生长缓慢，说明丛生芽内源激素含量较低，需要在培养基中添加外源激素；添加BA后增殖系数高于单独使用IBA或NAA；当使用IBA作为分裂素时，增殖出的芽生长缓慢，再生芽长势弱，同时加入BA后再生芽的长势稍好，但生长也缓慢，说明IBA不适宜铁皮石斛生长；当使用NAA作为分裂素时，再生芽芽势正常，且生长快，生长素与分裂素比例为1/2时更利于铁皮石斛的生长，当NAA浓度为0.5 mg·L-1、BA浓度为1 mg·L-1时再生芽长势健壮、生长快，增殖系数3.8。因此，最佳的增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA。

表3 不同培养基对铁皮石斛丛生芽增殖培养的影响

2.4 不同生长素对铁皮石斛组培苗生根生长的影响

由表4可知，在不同的培养基中铁皮石斛组培苗生根数量、长度及生根质量明显不同。在使用IAA作为生根诱导激素时，生根数量较少，根长较短，且诱导出的再生根基本都是短粗、生长缓慢的肉质根，不具有根的功能，移栽时不易成活；在使用NAA作为生根诱导激素时，诱导出的根生长迅速，平均根长明显长于IAA诱导出的根长，同时诱导出的均为生长正常的根，具有主动吸收功能，可以进行直接移栽。当NAA的用量为0.5 mg·L-1时，平均生根数为7.3条，平均根长达5.8 cm，且都为生长快的正常根。当继续增加NAA的用量时，再生出的根生长速度有一定的下降，且在个别植株上出现了玻璃化现象，说明高浓度的NAA开始对组培苗产生毒害作用。综上所述，最佳的铁皮石斛组培苗生根培养基配方是：MS+0.5 mg·L-1NAA。

表4 不同激素对铁皮石斛组培苗生根的影响

3 讨论

铁皮石斛再生植株具有多种获取途径，常用的方式是使用铁皮石斛种子进行无菌播种形成原球茎，再通过原球茎增殖分化发育成完整再生植株[12]；也可以通过诱导茎段、茎尖、幼芽或叶片等外植体形成丛生芽来获取再生植株[13]。本试验采用后者，以茎段为外植体，建立了一套完整的诱导腋芽萌发、增殖、生根培养快繁体系。

铁皮石斛使用工厂化生产育苗，可以在一定时间内生产大量整齐度良好的瓶苗[14]。在工厂化育苗中，使用种子扩繁要优于茎段，其优势主要体现在起始阶段的种子外植体感染率较低，且种子的增殖系数显著高于茎段等。但诱导种子萌发、诱导原球茎所需的周期较长，且因种子是通过杂交授粉得到的，其遗传性不稳定，由种子再生的植株经过多次继代受环境以及添加的外源激素的影响易改变其原有的性状，进而出现性状分离的现象。以茎段为外植体进行腋芽诱导增殖出来的植株其遗传稳定性高，能较好地保持原有亲本植株的性状[15]。

本试验选用30%次氯酸钠来对茎段进行外植体消毒，消毒10 min外植体污染率为6%，死亡率为0，消毒效果高于其他浓度的次氯酸钠以及HgCl2等常用消毒液[16-17]；诱导茎段腋芽萌发阶段可以通过采用添加一些外源激素来加快其增殖和生长，本试验诱导培养基为MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA，诱导系数5.6，再生芽生长快且健壮，增殖阶段采用生长素与分裂数比例为1/2时更适宜铁皮石斛的生长，丛生芽生长健壮、增殖率高，本试验增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA，增殖率3.8。综上所述，本研究以茎段为外植体，优化了铁皮石斛组培快繁体系，使用茎段诱导腋芽萌发增殖的方法可以成为一种稳定繁殖优株的途径，为铁皮石斛繁育和优质种苗生产提供了参考依据。