长沙市某鸡场混合感染禽白血病与马立克氏病毒的分子诊断

谭 丹，陈 智，邹建曾，刘增再，郑姣妹，唐爱明，王文梅，耿相昌，赖诗嘉周元中，宁华杰，黄 甜，王洪亮*

（1.长沙市动植物疫病预防控制中心，湖南长沙 410000；2.长沙市农业综合行政执法局，湖南长沙 410000；3.宁乡市动植物疫病预防控制中心，湖南宁乡 410600；4.浏阳市佳和养殖专业合作社，湖南浏阳 410300）

目前，在我国引起家禽传染性肿瘤病主要有3种，即疱疹病毒引起的马立克氏病（Marek′s disease，MD)，网状内皮组织增生病毒引起的网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis，RE)和禽白血病毒引起禽白血病（avian leukosis，AL)。现AL 和MD 在鸡群中较为常见，在我国虽然MD 疫苗的使用具有一定保护性，但近年来国内出现接种疫苗，鸡群依然发病的情况时有发生，尤其多病原的混合感染造成鸡生长抑制、产蛋性能下降、出现免疫抑制现象，甚至引发鸡群产生肿瘤和死亡等，给养鸡业造成了巨大损失。该文主要对长沙市某发病鸡群进行了ALV 和MDV 混合感染确诊和鉴定，并对ALV 的env 和MDV-meq 基因进行序列分析，丰富长沙市关于禽病的分子流行病学数据，为长沙市禽白血病和马立克氏病的净化与防治提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料来源于2020 年长沙市某养鸡场，检测为AIV 和MDV 感染阳性，采集发病和死亡鸡的组织病料及血清。经调查，该发病鸡群存栏2000 羽，170 日龄左右，发病鸡肉冠发白，消瘦、精神不良，翅膀下垂，排绿色稀薄粪便等临床症状，发病鸡陆续发生死亡，日死亡率为0.4%～2%。病死剖检可见全身内脏器官均出现肿大，尤其是肝脏、脾脏及肾脏，出现不同程度的肿瘤结节。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司、一步法RT-PCR 试剂盒购自天根生化科技（北京)有限公司、AIVH5/H7 双荧光核酸检测试剂盒、传染性法氏囊病核酸检测试剂盒、禽网状内皮增生症核酸检测试剂盒、禽白血病核酸检测试剂盒、马立克氏病核酸检测试剂盒5 种试剂盒均购自达安基因公司，引物由通用生物系统（安徽)有限公司合成（见表1)。

1.3 引物合成

用于测定ALV-env 基因、MDV-meq 基因的引物主要引用于参考文献[1，2]，引物序列见表1。

1.4 病毒鉴定与目的基因扩增及测序

结合鸡群的临床和剖检变化，初步怀疑为白血病和马立克氏病毒感染，对病死鸡的病料组织用病毒DNA/RNA 提取试剂盒进行核酸提取，核酸-80℃保存备用，取核酸分别加入禽流感、传染性法氏囊病、禽网状内皮增生症、禽白血病、马立克氏病的特异性引物进行检测，扩增体系分别按照AIVH5/H7 双荧光核酸检测试剂盒、传染性法氏囊病核酸检测试剂盒、禽网状内皮增生症核酸检测试剂盒、禽白血病核酸检测试剂盒、马立克氏病核酸检测试剂盒5 种试剂盒说明书进行荧光定量PCR 检测。

目的基因扩增：取5μL 核酸配制PCR 检测体系分别添加ALV-env 基因、MDV-meq 基因扩增引物进行基因扩增，ALV-env 基因扩增反应程序为：42℃30min；94℃ 5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃3min，35 个循环；72℃10min。MDV-meq 基因扩增反应程序：42℃30min；94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1min，35 个循环；72℃10min。将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定为目的条带后送至通用生物系统（安徽)有限公司进行序列测定。

1.5 序列分析

对测序公司获得的序列在NCBI 网站上对所测毒株进行BLAST 比对，同时利用MEGA5.0、DNAStar进行基因序列分析并绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒鉴定结果

经检测，马立克氏病、禽白血病核酸检测为阳性，结果见图1、图2，其他疫病检测均为阴性，将毒株命名为ALV-2010HUNAN，MDV-2010HUNAN。

图1 禽白血病毒核酸荧光PCR 检测结果

图2 马立克氏病毒核酸荧光PCR 检测结果

2.2 ALV env 基因序列及遗传进化分析

对扩增的ALV-env 基因序列测定后，下载参考序列进行比对分析，发现该文分离毒株env 基因序列与内源性E-ALV 代表毒株同源性最高为98.9%，与A-D群ALV 毒株同源性为81%～89.2%，与J 群ALV 毒株同源性最低为33.01%～40.5%。进化树显示，该毒株与内源性ALV 处于同一进化枝，判定该毒株为内源性ALV（图3)。

图3 分离毒株与参考毒株env 基因遗传进化树

2.3 MDV meq 基因序列及遗传进化分析

对扩增的MDV-meq 基因序列测定后，下载参考序列进行比对分析，发现分离株MDV-2010HUNAN的meq 序列与参考野毒GX0101 和疫苗毒CVI19898相比，在提供的meq 序列中不含有CVI988 特有的插入，因此判定所提供的序列为MDV 野毒。进一步对序列同源性和遗传进化关系进行分析，发现该毒株与我国MDV 野毒株处于同一进化分支，同源性为96.5%～99.2%（详见图4-图5)。

图4 分离毒株与参考毒株meq 基因同源性比较

图5 分离毒株与参考毒株meq 基因遗传进化树

3 讨论

根据本次鸡群发病的临床症状、病原学检测及病毒基因序列测定结果显示，引起本次鸡群发病死亡的主要原因为马立克氏野毒和E 群禽白血病毒混合感染所致。从我们所测得ALV-env 基因比对分析该毒株为E 群属于内源性病毒，据报道，ALV-env 基因是ALV引发鸡体产生肿瘤的主要基因之一，可根据核苷酸同源性比对来鉴定分离株的亚群[3]，本次分离毒株虽然为内源性毒株，但鸡场感染ALV 后会引起鸡群的免疫抑制，一旦MDV 野毒进入，两种病毒共同感染，会迅速增加病毒对鸡群的感染性和致病力，从而引起鸡群的严重的免疫抑制及肿瘤症状[4]。

meq 是MDV 原癌基因，参与肿瘤形成及免疫抑制[5]，本次分离的毒株meq 序列同源性和遗传进化关系进行分析，发现该毒株与我国MDV 我国流行野毒株处于同一进化分支，与国内强毒株GX0101 代表毒株同源性97.2%，处于同一大分支，很可能分离毒株为流行的强毒株，其具体致病性和致病型如何还有待进一步研究。

目前该类群ALV 尚无疫苗和药物进行防治，各地主要通过种禽场的净化和生物安全措施进行防控，长沙市2020 年以来尝试对培育的浏黄鸡等地方品种进行流调及禽白血病净化工作，虽然有些成效，但是还是存在零散发生。而MDV 的防控主要通过接种疫苗，疫苗主要有单价苗、二价苗、三价苗及重组DNA 疫苗4 大类[6]，虽然疫苗免疫能抵御一般毒株的侵袭，但有研究发现，部分MDV 的超强毒株及特超强毒株能突破疫苗免疫保护[7]，或者与其他免疫抑制性病毒的混合感染降低了鸡群对MD 疫苗的免疫应答效果，增加感染MDV 的几率，引起MDV 在鸡群的暴发。因此建议一是做好种鸡群净化，可在产蛋前经ELISA 或其他血清学检测，阳性鸡一次性淘汰，经三四代淘汰后，鸡群达到净化；二是做好疫苗免疫，严格按照免疫程序做好MD 及常规疫苗的免疫；三是加强饲养管理，保持良好养殖环境卫生，做好鸡舍、放养区及饲养用具等消毒工作，消毒药建议交替使用，同时做好球虫等驱虫工作。

4 结论

该文对采集病鸡组织病料进行病原的鉴定及重要基因的测序分析，表明此次病原主要是禽白血病病毒和马立克氏病毒混合感染，进一步序列分析ALV env 基因与内源性ALV 处于同一进化分支，MDV-meq 基因与我国MDV 野毒株处于同一进化分支，进一步说明该鸡群为MDV 野毒株和内源性ALV 的混合感染导致，建议后期鸡场在种源净化、疫苗免疫及生产管理方面做好禽白血病及马立克氏等疫病防控。