浊度法测定红霉素效价

杨玉玲，吴愫青

（珠海市食品药品检验所，广东 519000）

国际上抗生素效价测定以管碟法和浊度法并行，浊度法具有耗时短、灵敏度高、操作简单、人为影响因素少、测定结果准确度与精密度高的优点，《中国药典》自2005年版已收载浊度法。本文对红霉素效价测定的浊度法和管蝶法进行了相关试验，进一步比较管碟法、浊度法测定过程中的优缺点和影响因素。

1 材料与仪器

1.1 材料 金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、红霉素标准品（批号130307-201417，效价928 U/mg，由中国食品药品检定院提供）；红霉素肠溶片（批号11200203、11190308，来源于特一药业集团有限公司；批号190701，来源于广东华南药业集团有限公司）；红霉素肠溶胶囊（批号190104，来源于浙江华润三九众益制药有限公司）；依托红霉素片（批号11190604、11181203，来源于特一药业集团有限公司）；琥乙红霉素片（批号2102035020，来源于西安利君制药有限责任公司；批号A2105003，来源于石家庄以岭药业股份有限公司；批号A21100903，来源于浙江京新药业股份有限公司）；依托红霉素颗粒（批号211101，来源于湖北东信药业有限公司）；抗生素检定培养基3号（批号1100031，由广东环凯微生物科技有限公司提供）；氯化钠（批号20161012，来源于天津市百世化工有限公司）；磷酸二氢钾（批号20180226，来源于天津市大茂化学试剂厂）；磷酸氢二钾（批号20151001-11，来源于广州化学试剂厂）。

1.2 仪器WBS-100微生物比浊法测定仪（北京先驱威锋技术开发公司）；ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱威锋技术开发公司）；Sartorius CPA225D十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；Zealway GR110DR高压灭菌锅（致微仪器有限公司）；DHG-9123A恒温干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；量瓶、培养皿、移液管、刻度吸管。

2 方法

2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备 取金黄色葡萄球菌冻干菌1支，于生物安全柜内操作，用灭菌的0.9%氯化钠溶液适量将冻干菌溶解并转移至营养琼脂斜面上，于36℃培养26 h。再取营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于36℃培养20 h。待临用时，用灭菌水将菌苔洗下，作为实验用菌悬液。

2.2 供试品溶液和标准品溶液的制备 精密称取标准品和供试品（按照管碟法制备方法进行制备）适量，加灭菌水制成1 000 U/ml的溶液，再吸取5.0 ml 1 000 U/ml的溶液到100 ml量瓶中，定容至刻度得50 U/ml的溶液，备用。后续稀释用pH7.8的磷酸盐缓冲液稀释到适宜的浓度。可选择剂间比为2∶1或4∶1，抗生素最终浓度范围为0.1～0.85 U/ml，具体浓度可以根据培养结束后吸光度读数在线性范围内进行调整。如选择高低浓度为0.5和0.25 U/ml的制备过程如下：精密量取50 U/ml的溶液10.0 ml置于100 ml量瓶中，定容至刻度得5 U/ml的溶液，分别精密量取5 U/ml的溶液5.0 ml置于50 ml和100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成浓度为高浓度为0.5 U/ml、低浓度为0.25 U/ml的溶液。

2.3 供试品溶液和标准品溶液的分装 取经过高温灭菌的石英比色皿16支，分别标记为1S1～1S4共4支，2S1～2S4共4支，1T1～1T4共4支，2T1～2T4共4支，然后按照拉丁方的排列顺序分别排列好。精密吸取标准品溶液的高浓度溶液、低浓度溶液及供试品溶液的高浓度溶液、低浓度溶液各1.00 ml按标记的对应编号加入相应的比色皿中。加入标准品溶液和供试品溶液时，均在有标记处沿管壁缓缓加入。

2.4 含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养2～4 h后测定的吸光度在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。

2.5 培养基的分装 取含试验菌的液体培养基，分装至比色皿中，每管精密加入9 ml。加入培养基时，应在加入样品溶液的标记处稍上方，然后沿着管壁缓缓流入，以便将沾在管壁上的供试品溶液和标准品溶液一起冲入比色皿底部，待溶液和培养基全部加完后，盖上塞子，水平轻轻摇匀，使供试品溶液、标准品溶液和培养基混合均匀。

2.6 培养 使用WBS-100微生物比浊仪在37℃培养2～4 h。

2.7 测量与计算 使用WBS-100微生物比浊仪可进行恒温振荡培养并进行在线快速测量，测量后能进行自动计算并生成实验报告。

3 结果

3.1 线性及其范围试验 精密称取标准品（928 U/mg）适量，加灭菌水制成1 000 U/ml的溶液，用pH7.8的磷 酸 盐 缓 冲 液 分 别 稀 释 到0.10、0.15、0.20、0.265、0.37、0.51、0.72和1.00 U/ml的溶液，按浊度法操作。以浓度（C）的对数为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归。结果得到：Y=0.498 9X+0.043 6（r=0.997 5），说明在0.1～1 U/ml的浓度范围内，抗生素浓度的对数与吸光度呈直线关系。

3.2 精密度试验 取1 000 U/ml标准品溶液配制成浓度为0.25和0.5 U/ml的溶液，按照浊度法进行精密度试验，共测定9次，浊度法的精密度可以达到方法学验证的要求，RSD为0.6%。

3.3 回收率试验 选择90%、100%和110%三点进行回收率试验。精密称取标准品适量，加pH7.8的磷酸盐缓冲液制成1 000 U/ml的溶液。分别精密量取该溶液4.5、5.0和5.5 ml至100 ml的量瓶中，用pH7.8的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，得到45、50和55 U/ml的溶液，分别精密量取10.0 ml置于100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成浓度为4.5、5.0和5.5 U/ml的溶液。精密量取4.5 U/ml的溶液5.0 ml分别置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，制备成浓度为0.225和0.45 U/ml的溶液，作为试验用90%标准品溶液；精密量取5.0 U/ml的溶液5.0 ml分别置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，制备成浓度为0.25和0.5 U/ml的溶液，作为试验用100%标准品溶液；精密量取5.5 U/ml的溶液5.0 ml分别置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，制备成浓度为0.275和0.55 U/ml的溶液，作为试验用110%标准品溶液。按照浊度法进行试验，结果平均回收率为99.63%，RSD为0.3%。见表1。

表1 回收率试验结果

3.4 多个厂家、多个红霉素品种浊度法与管碟法测定结果的比较 本文选取了多个厂家的红霉素相关品种：红霉素肠溶片、依托红霉素片、红霉素肠溶胶囊、依托红霉素颗粒、琥乙红霉素片，分别采用两种方法进行测定。琥乙红霉素相关样品通过室温放置16 h或40℃放置6 h达到水解完全，依托红霉素相关样品通过60℃水浴中放置4 h达到水解完全，最后都是采用和红霉素标准品进行比较得出结果。水解时间是影响含量测定效价值的关键因素，水解时间短，样品水解不充分会导致最终结果偏低；水解时间过长，则会使水解得到的红霉素再发生降解，导致效价测定值发生偏差。结果表明，浊度法测定结果精密度高。见表2。

表2 多个厂家红霉素相关品种浊度法、管碟法测定结果比较

4 讨论

管碟法和浊度法都是在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。管碟法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小；浊度法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度［1］。

抗生素微生物检定法自40年代建立以来仍作为经典方法之一收载于各国药典，目前，管碟法、浊度法被作为抗生素微生物检定方法，收载于《中国药典》中。管碟法的缺点是专属性差，凡具有抗菌活性的物质都会干扰检验结果，并且操作步骤多、复杂，影响试验结果准确度的因素较多，需要从各个环节加以严格控制，减少结果误差。

浊度法测定抗生素效价时抗生素溶液的浓度非常低，微生物污染对浊度法测定效价有很大影响，因此试验器具采用单独浸泡、单独清洗的方式，可以减少试验过程的交叉污染。浊度法对试验用培养基的灵敏度的要求比较高，使用的培养基应澄明，颜色以尽量浅为佳，培养基经灭菌后、培养后本身不得出现沉淀。根据这一原则，通过对培养基的预试，挑选合适品牌的产品使用［2］。红霉素浊度法测定用试验菌为金黄色葡萄球菌，为保证试验的成功率，此菌悬液建议临用现制。经本试验验证，与微生物管碟法比较，浊度法具有快速（仅需3～4 h）、易于操作、可在线测定、采用液体培养法、无扩散因素影响、灵敏度高和精密度较好等优点，适用于红霉素及其相关品种的含量测定。

但是，抗生素效价测定对人员的专业技能和经验水平有较高的要求，检验人员上岗前应接受相应的培训，包括实验室生物安全方面、微生物检验技术及效价测定相关检测方法、程序、检测目的、检验中的影响因素等的培训，上岗后通过不断提高检验技能，掌握检验技巧，才能确保检验结果的准确性。

总之，伴随着高效液相色谱法等化学分析方法的发展和进一步应用，越来越多的抗生素微生物检定分析方法逐步被化学分析方法所取代，但是，对于多组分抗生素，抗生素微生物检定法仍然具有不可替代的优势。而且随着抗生素的广泛应用、新的抗菌药物的研发和近年来抗生素耐药性的产生，对于抗生素耐药菌株的分析和研究，抗生素微生物检定法也有着广阔的发展前景。