火针调控白细胞介素23/辅助性T 细胞17轴干预银屑病炎性机制的研究

王群 王鑫 刘璐 魏江艳 孙敬青

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,皮损局部以红斑鳞屑为主要表现,病情反复,缠绵难愈,往往给患者造成较大的经济负担和心理负担。 研究表明,2017 年全球银屑病总患病率介于0.09% ~5.10%之间,国内患病例数约866.5 万,国内外银屑病患病率均有逐年上升的趋势[1-3]。 目前国内主要以维A 酸类、维生素D3 衍生物、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗为主,但存在疗效不稳定、不良反应多、停药易复发等问题。 银屑病发病与遗传、环境及免疫失调等多种因素相关,其中白细胞介素(interleukin,IL)-23/辅助性T 细胞17(T helper cell 17,Th17)炎症轴具有关键作用[4],IL-23 和IL-17 作为重要促炎细胞因子[5]介导炎症放大和皮损恶化;IL-10 作为抗炎细胞因子,可能具有阻断IL-23/Th17轴的作用。 火针是将金属针烧至通红,迅速点刺穴位、皮肤的针法,具有抗炎消肿、调节免疫及激发自身机体良性调节机制的作用[6]。 研究表明,火针能够有效治疗银屑病,但目前有关火针治疗银屑病作用机制的研究较少[7]。 本实验通过咪喹莫特诱导小鼠构建银屑病模型,观察小鼠血清IL-23、IL-17 和IL-10 表达水平的变化,探究火针干预银屑病样皮损病变过程中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康 BALB/c 小鼠18 只,雄性,8 周龄,体质量(20±1.0)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010。 饲养温度20 ~25℃,相对湿度60%,予12 小时昼夜循环光照,可以自由获得食物及饮水,适应性饲养3 天。 本研究经首都医科大学动物实验机构伦理审查委员会批准(批准号:20201113)。

1.2 火针及药物

毫火针,苏州市华伦医疗用品有限公司,批号:210701;白凡士林,国药集团化学试剂有限公司,批号:20171206;咪喹莫特乳膏,四川明欣药业有限责任公司,批号:39210804。

1.3 实验试剂及仪器

苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色液(珠海贝索生物技术有限公司,批号:C200701),IL-10、 IL-23、 IL-17 ELISA 试 剂 盒 ( Phoenix Pharmaceuticals, Inc), Multiskan MK3 酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司),低温高速离心机(美国Beckman 公司),ASP6025 全封闭组织脱水机、EG1150 H+C 包埋机、RM2245 半自动轮转式切片机、APERIO CS2 显微镜(德国 Leica 公司)。

1.4 分组及造模

采用随机数字表法将18 只小鼠随机分为三组,对照组、模型组和火针组,每组6 只。 模型组和火针组采用咪喹莫特诱导法制备银屑病小鼠模型:小鼠背部2 cm×2 cm 皮肤区域剃毛,涂擦5%咪喹莫特乳膏,剂量 62.5 mg/只,1 次/天,连续 9 天[8]。 对照组同样方法涂抹等量凡士林。

1.5 干预方法

正常组:不作处理,第4 ~9 天每日抓取、固定。模型组:第4 ~9 天每日造模后抓取、固定。 火针组:第4 ~9 天每日造模后行火针点刺治疗:酒精灯外焰将火针烧至红白,迅速点刺双侧内关(约刺入0.5 mm)、双侧足三里(约刺入1.0 mm)。 取穴参照《实验针灸学》[9]。

1.6 取材

实验第10 天小鼠下腹腔注射1% 戊巴比妥(0.1 mL/10 g),深度麻醉后眼球取血、分离血清,置于-80℃冰箱保存备用;每组采用随机数字表法选取两只小鼠剪取背部病变皮肤组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定,待用。

1.7 观察指标及检测方法

1.7.1 小鼠皮损组织病理学 4%多聚甲醛溶液中待用皮肤组织固定72 小时后,脱水、包埋、切片(5 μm)、HE 染色、封片,显微镜下观察病理变化。

1.7.2 酶联免疫吸附法检查小鼠血清IL-10、IL-17和IL-23 表达水平 各试剂平衡至室温,加样品和标准品,37℃孵育90 分钟,弃液、洗版,每孔加入相应抗体工作液,37℃孵育90 分钟,弃液,洗板4 次,每孔加100 μL Streptavidin-HRP 工作液,37℃避光孵育30 分钟,弃液,洗板 4 次,每孔加 100 μL 底物显色工作液,37℃避光孵育30 分钟,每孔加100 μL终止液,终止反应后立即用酶标仪在波长450 nm 处测量各孔吸光度,计算相应浓度。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件分析结果数据,计量数据以均数±标准差()表示。 数据呈正态分布、方差齐时采用单因素方差分析,两组间比较用LSD检验;数据非正态分布或方差不齐时采用非参数检验,以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮损变化

对照组小鼠背部皮肤光滑,部分可见薄层毛发长出;模型组小鼠皮损处皮肤干燥,可见红斑、出血点、明显鳞屑附着及皮损边缘类束状发样改变;对照组较模型组红斑、鳞屑及浸润程度有所减轻。 见图1。

图1 各组小鼠皮损情况变化比较

2.2 各组小鼠皮损病理变化

对照组小鼠皮肤病理可见表皮层极薄,真皮层无毛细血管扩张增生,无炎性细胞浸润;模型组可见表皮角化不全、角化过度,棘层明显增厚,表皮突水肿增粗,真皮层毛细血管扩张增生,真皮浅层炎性细胞浸润;相较于模型组,火针组棘层肥厚明显减轻。 见图 2。

图2 各组小鼠皮损病理情况比较

2.3 各组小鼠血清IL-10、IL-17 和IL-23 表达水平变化

与对照组相比,模型组小鼠血清IL-10 表达水平显著下降,IL-23 和IL-17 表达水平显著上升,具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,火针组小鼠血清IL-10 表达水平显著上升,IL-23 和IL-17 表达水平显著下降,具有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表达水平比较(,pg/mL)

表1 各组小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表达水平比较(,pg/mL)

注: 与对照组相比,aP<0.05,bP<0.01;与模型组相比,cP<0.05。

IL-10 IL-17 IL-23对照组组别 鼠只6 164.37±24.40 40.34±6.72 5.88±0.77模型组 6 142.45±12.31a 51.20±7.45a 7.50±1.08b火针组 6 166.25±13.92c 41.10±7.38c 6.51±0.41c

3 讨论

银屑病是一种免疫介导的炎性皮肤病,其发生发展与免疫失调密切相关。 IL-23/Th17 轴被确定为银屑病发病机制中的主要免疫通路[5]。 IL-23 主要由活化的抗原提呈细胞(APCs)产生,如树突状细胞和单核/巨噬细胞[10],对维持Th17 细胞高水平分泌以IL-17 为主的炎性细胞因子至关重要[11-13]。 有研究表明,IL-10 能够抑制APCs 及抗原呈递过程[14-15]和直接抑制Th17 细胞的促炎作用[14,16], 很可能对IL-23/Th17 轴具有阻断作用。 研究表明,相较于正常人,寻常型银屑病患者血清IL-23、IL-17 表达水平显著升高的同时,IL-10 表达水平显著下降,与本研究结果一致[17-18]。 证明在银屑病发病过程中,IL-23/Th17炎症轴放大的同时,IL-10 表达受抑制。本研究结果表明,火针能够抑制银屑病模型小鼠血清IL-23 和IL-17 的表达,同时提高IL-10 表达水平。证明火针可能通过促进 IL-10 表达,抑制 IL-23/Th17 炎症轴从而发挥抗炎作用,以改善银屑病样皮损病变。

火针疗法源远流长,在《灵枢》中被称为“焠刺”。 随着对火针的不断改进,毫火针具有疼痛轻、创伤小、安全性更高等优势,现已被用于治疗皮肤科诸多病种[19]。 中医认为,火针借助火之温热,具有助阳益气、舒筋通络、祛瘀行滞、活血除湿、调节脏腑等功效。 现代研究发现火针能够激发机体自我调节机制,加快炎性物质吸收,调节多种参与炎症反应的细胞因子含量及免疫细胞平衡实现抗炎消肿、调节机体免疫功能的作用[6]。 文献研究表明,火针对银屑病的疗效是肯定的[7]。 不过有医家在应用火针治疗银屑病过程中出现皮损加重的情况,这可能与银屑病分期、取穴、针刺密度和深度等有关。 一般认为银屑病进行期应当尽量避免皮肤刺激,避免同形反应,此时处在病情进展期,尽管治疗方式无误,也可能出现皮损不减反增的情况。 本研究选择远端取穴,在第4 ~9 天进行火针治疗,表明可能在银屑病进行期,亦可以选择火针干预,为临床选用火针治疗银屑病提供实验依据。

目前中医机制方面,主流研究认为痰湿是银屑病的主要病机之一,治疗当以健脾运脾为主[20],脾虚也确实会加重银屑病样皮损病变[21],为健脾化湿治则提供了选穴依据。 名老中医王乐亭先生所创“老十针”是其治疗脾胃疾病的学术思想精髓[22],内关、足三里是此针灸处方中四肢所选之穴,二者善治胃肠腑病症,具有健脾行气、益胃止痛之效。本研究以内关、足三里为选穴,一为从脾胃论治银屑病,二为远端取穴,避免局部刺激。 银屑病病机复杂,临床的分期治疗和选穴方法有待进一步研究。

本研究发现火针能够抑制IL-23 和IL-17 表达、上调IL-10 表达水平,证明火针很可能是通过促进IL-10 表达来抑制IL-23/IL-17 炎症轴,从而发挥抗炎作用以改善银屑病样皮损病变。 近些年来,生物制剂发展迅猛,与之相比火针仍然具有更廉价、更高安全性等优势,临床银屑病常采用多联疗法以提高疗效,其中针灸治疗是中医治疗银屑病的重要手段。 关于火针治疗银屑病更完备、更深层的作用通路,尚需进一步探究,以更好地指导火针与其他药物联合应用提高临床疗效。