离子通道蛋白Piezo1对肺细胞癌侵袭和增殖的作用

王 佳，马军伟，王 凯

(1延安大学附属医院肿瘤科一病区，延安 716000；2延安大学附属医院胸外科；*通讯作者,E-mail:496849528@qq.com)

肺癌是临床上较为常见的肿瘤性疾病，随着环境污染的加剧，大气中有害物质的增加，吸烟人群的居高不下，以及厨房烟尘的影响，肺癌的发病率逐年增加。既往研究[1]显示肺癌的发病率约为(20～50)/10万，位居我国肿瘤类疾病发病率的第一位，因此，阐明肺癌的发病机制十分重要。新型机械敏感性离子通道蛋白Piezo1是目前的明星分子，与真核细胞增殖以及干细胞的分化均具有一定的作用，是“诺贝尔奖”级别的发现[2]。Piezo1蛋白的表达与胃癌细胞的增殖密切相关[3]，还有研究认为Piezo1蛋白与骨肉瘤的发生和发展密切相关[4]。但是，关于Piezo1蛋白在肺癌中的表达以及可能的作用机制尚未见报道，因此，本研究将以肺细胞癌为研究对象，探究Piezo1在肺癌细胞侵袭和增殖中的作用，以期为临床上肺癌的诊断和治疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料来源

本研究以自2019年1月至2021年1月收治延安大学附属医院肿瘤科一病区89例非小细胞肺癌患者为研究对象，所有患者均选择胸腔镜下行肺叶切除术，收集非小细胞肺癌组织和周边正常肺癌组织。所有入组患者均签署知情同意书，本研究方案通过延安大学附属医院伦理委员会批准。

选择非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H1299为种子细胞，细胞系均由中国科学院基础医学与肿瘤研究所杨玉和博士惠赠。

10只SPF级裸鼠购自山东省济南市实验动物中心(SCXK(鲁)2021-7846)。饲养环境为温度在18～26 ℃，相对湿度40%～70%，噪音85 dB以下，氨浓度7.6 mg/m3以下，通风换气8～12次/h。

1.2 免疫组织化学染色

采用ABC法对收集非小细胞肺癌组织和周边正常肺癌组织进行免疫组织化学染色法进行检测，将肺癌组织置入4%多聚甲醛进行固定，然后进行脱水，石蜡固定处理，利用切片机对组织样本进行切片处理，厚度为5 μm，然后利用二甲苯进行脱蜡，流程为：二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，无水乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，自来水冲洗5 min，利用枸橼酸溶液进行抗原修复，3%H2O2进行处理，5%BSA血清固定，加入Piezo1一抗进行孵育，4%避光孵育60 min，PBS清洗后加入二抗，避光孵育20 min，然后进行水洗，分化，脱水并固定，倒置光学显微镜下观察。

1.3 qRT-PCR检测肺癌组织中Piezo1的mRNA相对表达量

无痛苦处死上述裸鼠后，收集100 mg肺癌组织和癌旁组织，利用Trizol法提取上述肺癌组织的总RNA，然后用逆转录试剂盒将总RNA逆转为cDNA，其目的是可以方便保存，防止降解。采用荧光定量qPCR试剂盒分析上述各组细胞中的DNA样本，Tm值设置为53.7 ℃，将反应混合物加热至94～98 ℃并保持20～30 s用以DNA变性处理，变性后，将温度降至50～65 ℃进行退火处理，该步骤将持续约20～40 s以完全退火。采用2-ΔΔCt法进行分析。引物设计由上海生工公司设计并检测合格，对照基因为GAPDH，引物序列见表1。

表1 Piezo1的引物序列Table 1 The Primer sequence of Piezo1

1.4 慢病毒载体介导的siRNA沉默质粒的构建

利用数据库Web of Science(WOS)的基因数据库查询基因Piezo1的基因序列，然后利用siRNA沉默质粒构建原则，构建Piezo1的沉默质粒的基因序列，即3′-GATTGCTGTGAAGTCTCGA-5′，利用siRNA沉默质粒构建原则，逆转录RNA为cDNA，然后利用基因组文库的方法构建siRNA沉默质粒，利用慢病毒载体构建原则，将Piezo1的沉默质粒转染肺癌细胞，利用倒置光学显微镜检测转染效率。慢病毒转染效率=荧光镜下细胞数/白光镜下细胞数×100%。

1.5 实验细胞分组

根据siRNA-Piezo1的处理方案，将非小细胞肺癌系细胞A549和NCI-H1299各自分成siRNA-Piezo1干扰组和对照组，siRNA-Piezo1干扰组的非小细胞肺癌系细胞A549和NCI-H1299均转染siRNA-Piezo1的慢病毒载体，剂量为100 μl，MOI=50，而对照组的非小细胞肺癌系A549和NCI-H1299细胞转染空白质粒的慢病毒载体，剂量为100 μl，MOI=50。

1.6 CCK-8试剂盒检测细胞的增殖

根据试剂盒要求，配置各个试剂，将siRNA-Piezo1干扰组和对照组重悬后，接种于96孔板，按照说明书要求设置对比孔。然后加入CCK-8试剂盒中的检测试剂，37 ℃恒温避光孵育15 min，酶标仪测定各组细胞的吸光度(OD值)。

1.7 Transwell试剂盒检测细胞侵袭

将siRNA-Piezo1干扰组和对照组细胞重悬后，收集各组细胞，按照Transwell试剂盒的说明书要求，将各组细胞接种于Transwell侵袭上室，37 ℃恒温避光孵育2 h，然后更换无血清的培养基，Transwell下室加入含血清的培养基，37 ℃恒温避光孵育24 h，加入结晶紫试剂，常温避光孵育15 min，倒置光学显微镜观察下室细胞数，则为细胞侵袭数量。

1.8 裸鼠体外实验

以10只SPF级裸鼠为研究对象，构建非小细胞肺癌的成瘤模型，选择4～6周的裸鼠，采用皮下注射非小细胞肺癌细胞系的方法，剂量为5×106个/100 μl，1次/d，皮下注射，持续2周，2周后成瘤。根据是否皮下注射siRNA-Piezo1干扰质粒将裸鼠分成对照组和siRNA-Piezo1干扰组。siRNA-Piezo1干扰组裸鼠成瘤后皮下注射siRNA-Piezo1干扰质粒，对照组皮下注射PBS溶液。构建成功后，裸鼠成瘤后1，2，3，4，5周无痛苦处死裸鼠，收集肿瘤组织，称重后记录肿瘤的质量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

结果显示，肺癌组织中Piezo1的蛋白含量明显高于癌旁组织(P<0.05)。并且低分化的肺癌组织中Piezo1的蛋白含量明显高于中分化肺癌组织和高分化肺癌组织(P<0.05，见图1)。

图1 免疫组织化学法检测肺癌组织与癌旁组织中Piezo1的表达 (×100)Figure 1 Piezo1 expression in lung cancer tissues and adjacent tissues by immunohistochemistry (×100)

2.2 癌旁组织与肺癌组织中Piezo1的表达情况

结果显示，低分化、中分化和高分化肺癌组织的Piezo1的mRNA相对表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。且低分化肺癌组织中Piezo1的mRNA相对表达量明显高于中分化肺癌组织和高分化肺癌组织(P<0.05，见表2)。

表2 qRT-PCR法检测各组Piezo1的mRNA表达量Table 2 Piezo1 mRNA expression in each group detected by

2.3 慢病毒介导siRNA-Piezo1转染A549细胞和NCI-H1299细胞

结果显示，慢病毒介导的siRNA-Piezo1质粒可以转染A549细胞和NCI-H1299细胞，转染效率为(80.23±6.11)%(见图2)，满足后续实验要求，可以进行下一步实验。

图2 免疫荧光法检测A549细胞和NCI-H1299细胞中siRNA-Piezo1慢病毒质粒的转染效率 (×100)Figure 2 Transfection efficiency of siRNA-Piezo1 lentivirus plasmid in A549 cells and NCI-H1299 cells detected by immunofluorescence (×100)

2.4 CCK-8试剂盒检测细胞增殖

结果显示，慢病毒介导siRNA-Piezo1转染A549细胞和NCI-H1299细胞后，siRNA-Piezo1干扰组细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05，见图3)。

与对照组比较，*P<0.05图3 CCK-8实验法检测对照组和siRNA-Piezo1干扰组的细胞增殖率Figure 3 Cell proliferation rate in control group and siRNA Piezo1 interference group by CCK-8

2.5 细胞的侵袭能力结果

结果显示，siRNA-Piezo1干扰组A549细胞和NCI-H1299细胞侵袭能力明显低于对照组(P<0.05，见图4)。

图4 Transwell实验法检测对照组和siRNA-Piezo1干扰组的细胞的侵袭结果 (×200)Figure 4 Invasion of A549 cells and NCI-H1299 in control group and siRNA Piezo1 interference group by Transwell (×200)

2.6 裸鼠肿瘤接种结果

结果显示，裸鼠接种后1，2，3，4，5周后称取肿瘤组织，siRNA-Piezo1干扰组肿瘤组织的质量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

与对照组比较，*P<0.05图5 siRNA-Piezo1干扰组和对照组裸鼠成瘤后的肿瘤质量比较Figure 5 Comparison of tumor weight between siRNA-Piezo1 interference group and control group after tumorigenesis

3 讨论

肺癌是临床上常见的肿瘤类型，尤其是非小细胞型肺癌，具有侵袭能力强、预后差的特点[5]。在既往研究中，非小细胞肺癌的发生和进展与多种基因的差异性表达有关，比如TRIM28基因，以A549细胞为研究对象，TRIM28基因的沉默载体可以抑制细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增长[6]。因此，利用siRNA干扰技术对相关基因进行沉默表达是一种可靠的技术手段。本研究利用siRNA干扰技术对靶基因进行沉默表达，探究靶基因对肺癌细胞增殖和侵袭的相关作用，以期为临床上非小细胞肺癌的治疗提供新思路。

Piezo1蛋白是目前研究较多的明星分子，与多种疾病的发生和进展密切相关，比如遗传性干瘪细胞增多症、骨关节炎、骨肉瘤等[7-9]。Piezo1是同源三聚体、螺旋桨状的结构，Piezo1形成三聚体三叶螺旋桨状离子通道，中心是负责离子通透的孔道部分，外周是3个负责机械力感知的桨叶部分，在孔道处于关闭态，嵌在细胞膜中的桨叶呈现往细胞外高度弯曲的状态，提示其可以弯曲其所在的细胞膜，形成纳米碗(nanobowl)状的PIEZO-脂膜体系[10]。在Piezo1的功能学研究中，有学者探究了Piezo1蛋白在骨肉瘤细胞中侵袭和凋亡的作用，结果表明，siRNA-Piezo1可以降低骨肉瘤细胞的侵袭和增殖能力[9]。也有研究证明沉默Piezo1蛋白的表达后，可以抑制胃癌细胞的侵袭和凋亡[11,12]。在本研究中，以非小细胞肺癌的A549细胞和NCI-H1299细胞系为研究对象，探究siRNA-Piezo1对肿瘤细胞的侵袭和增殖的相关作用，结果证明，siRNA-Piezo1转染A549细胞和NCI-H1299细胞后，siRNA-Piezo1干扰组细胞侵袭能力和增殖能力明显低于对照组，说明Piezo1与肺癌细胞的增殖和侵袭密切相关，利用siRNA将Piezo1基因沉默后，非小细胞肺癌的A549细胞和NCI-H1299细胞增殖能力明显下降，细胞侵袭水平明显降低。

裸鼠作为体外研究的动物模型，一直是肿瘤学领域较为熟悉的动物模型，在既往研究中，以裸鼠为动物模型，研究lncRNA PVT1的相关机制，结果可信度高[13]。因此，除了细胞学研究之外，在本研究中，也采用裸鼠模型，利用siRNA-Piezo1质粒沉默Piezo1基因表达，然后将肺癌细胞接种裸鼠，本研究结果证明，siRNA-Piezo1干扰组裸鼠肿瘤组织体质量明显低于对照组，分析原因，Piezo1蛋白的表达与肿瘤细胞的增殖密切相关，利用siRNA质粒沉默后，可以降低肿瘤质量。

但是，本研究也存在一定的不足，比如本研究尚未涉及siRNA-Piezo1沉默质粒调控肺癌细胞增殖和侵袭的机制，在后续研究中会进一步探究siRNA-Piezo1的相关作用机制。