双螺杆挤压耦合碱预处理对芦苇酶解效果的影响

徐 佳，张智强，王颖赛，李 园，冯昆鹏，周生飞

(雄安创新研究院，河北雄安新区 071700)

芦苇是一种多年生草本植物，广泛分布在湖泊和湿地等非耕地环境中，生长速度快，廉价易得。特别是作为中国四大芦苇产地之一的河北省白洋淀地区，芦苇分布面积约6 000 hm2[1]，伴随社会发展其逐渐失去了原有的经济价值，开发一种芦苇资源化利用的新模式具有重要意义。芦苇秸秆含有大量的纤维素和半纤维素，但其复杂的交联结构限制了酶解转化效率。预处理用于打破芦苇纤维的结构屏障，增大孔隙率和去除木质素，使纤维更容易转化为单糖。尽管人们已经对芦苇的预处理方法进行了相关研究，包括酸、碱、水热、有机溶剂等，但这些方法酶解得率较低[2-4]，且存在一些缺点，例如：水热处理中的高需水量和能耗，酸处理中对设备的高要求，溶剂法所用试剂的昂贵等，使其在工业化应用中受到限制。

双螺杆挤压是一种连续的预处理过程，具有反应条件温和、混合能力强、剪切力高和成本低等特点，近些年人们采用该方法进行了小麦秸秆[5]、玉米秸秆[6]、水稻秸秆[7]和甘蔗渣[8]等不同生物质制备可发酵糖的应用研究。采用双螺杆挤压可以破裂木质纤维素的顽固结构，增加水解时的反应面积，提高酶解效率[9]。目前，其在芦苇预处理技术中的应用案例尚未见报道。

本研究对芦苇进行了双螺杆挤压耦合碱预处理的相关实验验证，考察双螺杆螺纹元件、螺杆转速、碱用量、处理温度和保温时间对芦苇酶解效果的影响，对比不同预处理前后芦苇纤维结构和化学组成的变化，并通过对预处理后芦苇的逆流洗涤工艺优化，建立一种低能耗、水耗和酶用量的芦苇预处理工艺方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

芦苇，取自河北省雄安新区白洋淀，除去灰尘和杂质并晾干后将其切割至5 cm左右碎段；氢氧化钾、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、柠檬酸、柠檬酸钠等，均为分析纯；葡萄糖、木糖和阿拉伯糖(Sigma)；纤维素酶(Cellic CTec3，Novozymes)。

TSP120双螺杆挤压浸渍机，江苏金沃机械有限公司提供；UV-1800紫外分光光度计，上海菁华公司提供；LC-40D高效液相色谱仪，日本岛津公司提供；TM4000 Plus扫描电子显微镜，日本日立公司提供；Spectrum 3红外光谱仪，美国铂金埃尔默公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇

称取定量芦苇，按照进料浓度25%加至双螺杆挤压浸渍机中，设计不同的螺纹元件组合1(30 mm+28 mm+24 mm+22 mm)和组合2(24 mm+22 mm+16 mm+14 mm)以及螺杆转速150，200，250 r/min进行处理，挤压后将试样进行碱处理，处理条件：KOH用量4%(质量分数，下同)、处理温度90 ℃、保温时间3 h，预处理后试样经水洗至中性进行酶解实验。

取双螺杆挤压处理后的物料，设计不同KOH用量1%，2%，3%，4%和5%，处理温度为50，60，70，80，90 ℃，保温时间为0.5，1，2，3，4 h，预处理后将试样水洗至中性进行酶解实验。

1.2.2 芦苇的化学组分测定

芦苇预处理前后纤维素、半纤维和木质素的含量按照美国国家可再生能源实验室(NREL)方法进行测定[10]。

1.2.3 芦苇酶水解

双螺杆挤压耦合碱预处理工艺优化与不同预处理方式的芦苇酶解效果评价，均采用以下条件进行。控制底物浓度为10%(底物质量以绝干物料计)，用0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液调节pH值为4.8，纤维素酶(Cellic CTec 3)的添加量为10 FPU/g底物，低于已报道芦苇酶水解研究中的15～30 FPU/g底物的用量[11-13]。在50 ℃条件下，于150 r/min水浴恒温振荡48 h，酶水解液用沸水浴处理10 min后，12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[14]测定还原糖浓度来评估酶解效果，总糖得率(RS)按式(1)计算：

式中：C为还原糖质量浓度，g/L；V为酶水解液体积，L；m1为预处理后芦苇干重，g；m2为预处理前芦苇干重，g。

图1 芦苇酶解制糖工艺流程 Fig.1 Process of sugar production by reed enzyme hydrolysis

1.2.4 扫描电子显微镜观察

芦苇预处理前后的试样经压片、喷金处理后，采用扫描电子显微镜在15 kV加速电压下观察芦苇纤维的结构变化。

1.2.5 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测定

芦苇预处理前后的试样经研磨后，采用傅里叶变换红外光谱仪进行分析，波数范围为500～4 000 cm-1，分辨率为1 cm-1。

1.2.6 逆流洗涤

芦苇经双螺杆挤压耦合碱预处理后，按照图1中洗涤模式进行清洗，设计用水量分别为固液比为1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，物料经逆流洗涤后，分别取第1至第4次洗涤液测定电导率，洗涤后的物料用H2SO4调节pH值为4.8，进行酶解实验。

2 结果与分析

2.1 双螺杆挤压耦合碱预处理对芦苇酶解的影响

2.1.1 螺纹元件组合

双螺杆挤压机的螺杆上配置了4套螺纹元件。第1套用于切割，减少纤维长度；第2套用于破碎，使芦苇的外表面纤维化；第3套用于混合和脱水，从芦苇中除去部分水分；第4套用于撕裂和压缩，使芦苇内部纤维化。如图2所示，采用螺纹元件组合2的螺杆配置，芦苇经挤压处理后纤维细化程度更高，具有较优的破碎和剪切效果。实验结果表明，组合2还原糖产量和总糖得率比组合1分别提高了12.0%和9.7%(见表1)，组合2的螺纹元件配置更适合用于双螺杆挤压处理芦苇。

图2 不同螺纹元件挤压处理芦苇效果Fig.2 Effect of extrusion pretreatment of reed with different thread elements

表1 不同螺纹元件组合对芦苇酶解效果的影响Tab.1 Effect of different thread element combinations on the enzymatic hydrolysis of reeds

表2 不同螺杆转速对芦苇酶解效果的影响Tab.2 Effect of different screw speeds on the enzymatic hydrolysis of reeds

2.1.2 螺杆转速

随着双螺杆挤压机的螺杆转速从150 r/min增加到250 r/min，芦苇预处理试样经酶水解后的总糖得率从45.40%下降至43.78%(见表2)。这主要是由于随着螺杆速度的提高，芦苇在挤压机中的停留时间从70 s减少到40 s，在不显著影响生产效率的前提下，150 r/min的螺杆转速有助于提高芦苇物理结构的破坏程度，降低纤维素的结晶度，增加酶作用的表面积。

2.1.3 碱用量

图3 不同KOH用量对芦苇酶解效果的影响 Fig.3 Effect of different potassium hydroxide dosages on the enzymatic hydrolysis of reeds

选取双螺杆挤压机的螺纹元件配置为组合2、螺杆转速为150 r/min作为挤压处理的工艺参数开展后续实验研究。如图3所示，在不同碱用量、处理温度90 ℃、保温时间3 h的条件下，当KOH用量增加时，预处理后芦苇酶水解的还原糖产量逐渐提高。这主要是由于芦苇中的半纤维素和木质素在碱催化下发生一定程度的水解，从紧密的结构中溶出，打破了纤维素周围围绕的物理屏障，减少了对纤维素酶的无效吸附[15]。但是碱添加量从4%进一步增加时，随着纤维素和半纤维素降解导致的损失，以及因细小纤维增加造成洗涤后固体回收率的降低，使总糖得率由46.30%下降至45.21%，因而4%的KOH添加量对双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇较为适宜。

2.1.4 处理温度

图4 不同处理温度对芦苇酶解效果的影响 Fig.4 Effect of different processing temperature on the enzymatic hydrolysis of reeds

在预处理过程中，升高温度可以增加化学反应速率，提升纤维的化学组分脱除率，使芦苇纤维内部形成疏松多孔的结构，多糖组分更容易与酶进行反应。图4为芦苇经挤压处理、KOH用量为4%、在不同处理温度下维持3 h后酶水解的还原糖产量和总糖得率情况。由图4可以看出，随着处理温度的升高，预处理后芦苇的酶解效果有明显提升，常压条件下在90 ℃时达到最大值，考虑到工业化实施的设备需求性、经济可行性和预处理效率，处理温度为90 ℃较为适宜。

2.1.5 保温时间

在KOH用量为4%、处理温度为90 ℃的条件下，考察不同保温时间对预处理后芦苇酶解效果的影响，结果见图5。芦苇中的蜡质和纤维化学组分在碱性条件下的降解过程需要时间积累，不能够在瞬间完成，因而保温处理对提高芦苇酶解总糖得率是必要的。从图5中可以看出，随着保温时间的延长，导致有机化合物、灰分、木质素、半纤维素和纤维素等逐渐水解或溶出，提高了纤维素的可及性，还原糖产量增加，当保温时间从2 h继续增加时，总糖得率反而有一定程度的下降。这是因为当反应进行到一定时间后，木质素的脱除率将不再显著增加，而纤维素和半纤维素的降解率逐渐提升，造成纤维中多糖组分的绝对含量减少，所以选择2 h的保温时间作为最适宜工艺条件。

2.2 不同预处理方式对芦苇化学组分的影响

图6显示的是芦苇未处理(UT)、双螺杆挤压处理(SE，螺纹元件组合2+螺杆转速150 r/min)、碱处理(AL，KOH用量为4%，90 ℃，保温2 h)和双螺杆挤压耦合碱处理(SE-AL，螺纹元件组合2+螺杆转速150 r/min，KOH用量为4%，90 ℃，保温2 h)的化学组分变化情况。结果表明，与未处理芦苇相比，双螺杆挤压处理通过物理剪切和摩擦对芦苇的纤维结构进行破坏，导致细胞壁结构破裂，更多纤维素表面暴露出来，但其化学组分无明显变化；KOH可以破坏纤维素与半纤维素之间的氢键和半纤维素与木质素之间的酯键[16]，使木质素和部分半纤维素在处理过程中降解溶于碱液中，提升了预处理后芦苇的纤维素组分，木质素组分大幅降低；而与单一碱处理相比，经双螺杆挤压打破了芦苇纤维的致密结构，耦合碱处理后增加了碱液的接触面积，从而使木质素的脱除率较单一碱处理提高9.8%，同时提高了纤维素的溶胀效果，促进了纤维素结晶度的降低。

图5 不同保温时间对芦苇酶解效果的影响 Fig.5 Effect of different holding time on the enzymatic hydrolysis of reeds

图6 芦苇不同预处理方式的化学组分变化 Fig.6 Changes in chemical composition of differentpretreatment methods of reeds

2.3 不同预处理方式对芦苇酶解效果的影响

图7 芦苇不同预处理方式的酶解效果 Fig.7 Enzymatic hydrolysis effect of different pretreatment methods of reeds

从图7可以看出，芦苇采用双螺杆挤压耦合碱预处理效果明显优于其他方法，经酶水解后的还原糖产量可达到77.31 g/L，总糖得率比未处理芦苇提高1.64倍。结果表明，双螺杆挤压预处理通过物理作用将芦苇切碎并撕裂，降低了物料粒径，使纤维细化，提高了比表面积，由于芦苇表面蜡质和木质素未能脱除，导致酶水解效率难以有效提升。碱处理可以使芦苇中的蜡质溶出，打断木质素与半纤维素化学交联键，脱除木质素和半纤维素，使纤维素结晶区裸露出来，从而显著提升酶解得率。而双螺杆挤压与碱结合预处理芦苇，兼具了两者的处理效果，并有协同增效作用，挤压使芦苇纤维的结构破裂，提升了碱对木质素、半纤维素和蜡质溶解去除率，增加了纤维素的可及度，纤维孔径、孔隙率和表面积进一步增大，双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇的酶解总糖得率比双螺杆挤压和碱处理分别提高73.5%和36.8%。此外，双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇酶解后获得总糖得率比报道的其他预处理方法要高。例如：CHEN等[17]采用水热结合乳酸预处理芦苇，ZHANG等[18]采用DES预处理芦苇，总糖得率分别为0.39 g/g干芦苇和0.30 g/g干芦苇。而COIMBRA等[19]采用碱挤压处理小麦秸秆，在NaOH用量为10%、温度为70 ℃的条件下，使用42 FPU/g干物料较高酶负荷水解后，总糖得率为0.41 g/g干小麦秸秆。另一项研究中，ZHANG等[20]对玉米秸秆进行了双螺杆挤压联合碱处理，在NaOH用量为4%、温度为140 ℃的条件下，使用0.028 g/g干秸秆的纤维素酶对预处理后的物料水解后，总糖得率为0.44 g/g干玉米秸秆。因此，实验得出的双螺杆挤压耦合碱预处理最佳工艺，条件温和，成本低，酶负荷用量少，酶解效率高，是一种具有大规模工业生产应用前景的技术。

2.4 扫描电子显微镜分析

从图8不同方法预处理后芦苇的扫描电子显微镜照片中可以观察到，未处理芦苇样品的细胞壁结构整齐有序，表面光滑紧密；经挤压处理后的芦苇，在螺杆剪切和揉搓作用下纤维结构被切断打乱，使纤维从细胞壁中暴露出；碱处理可以使芦苇中一些组分溶出，导致表面变得粗糙松散，且留有狭长的缝隙，增加了孔隙率和比表面积；而双螺杆挤压耦合碱处理进一步改善了芦苇的预处理效果，在联合作用下芦苇纤维更加纤细，并分丝帚化，解离成单独的纤维和纤维束，表面褶皱并出现断裂，纤维的比表面积增加，有利于酶的吸附，因而双螺杆挤压和碱的耦合作用提升了酶的水解效果。

图8 芦苇不同预处理前后扫描电子显微镜图片(×500倍)Fig.8 SEM images of reed before and after different pretreatments(×500 times)

2.5 傅里叶变化红外光谱分析

图9 不同预处理方式前后芦苇的红外光谱图 Fig.9 FTIR images of reed before and after different pretreatments

图9为芦苇不同预处理方式的红外光谱图，3 380 cm-1处为纤维素分子内—OH伸缩振动吸收峰[21]，经预处理后该吸收峰强度减弱，表明纤维素的氢键被破坏；2 917 cm-1和2 850 cm-1处分别为木质素和脂肪族化合物中—CH3和—CH2的C—H键的反对称伸缩振动吸收峰和对称伸缩振动吸收峰[22]，经碱处理和双螺杆挤压耦合碱处理后，两处吸收峰强度明显减弱，说明芦苇中的木质素和蜡质均不同程度被去除；1 731 cm-1处为木质素和半纤维素中—C=O的伸缩振动吸收峰，该处吸收峰强度在经碱处理和双螺杆挤压耦合碱处理后减弱，说明预处理导致木质素和半纤维素之间酯键的断裂；1 600～1 460 cm-1处为芳香族苯环骨架振动吸收峰，属于木质素的特征吸收峰[23]，此处吸收峰强度的减弱说明碱处理对木质素的结构产生破坏从而被脱除，双螺杆挤压耦合碱处理对木质素的去除有增效作用；1 030 cm-1处为Si—O—Si键的反对称吸收峰[24]，预处理后吸收峰强度减弱，说明芦苇中SiO2有不同程度的去除。

2.6 逆流洗涤用水量对芦苇酶解的影响

芦苇采用双螺杆挤压耦合KOH预处理后，脱除的木质素及蜡质和产生的有机酸与酚醛等如不清洗会残留在物料中，影响酶解效率[25-26]。采用逆流洗涤方式可以在有效去除酶解抑制物的基础上，减少用水量，避免废水排放。如图10所示，预处理后芦苇在逆流洗涤模式下清洗，洗涤废液的电导率显著下降，最低可降至0.4 mS/cm以下。由图11可知，与预处理后未经洗涤的芦苇相比，逆流洗涤后试样的酶解效果明显改善，在固液比为1∶8用水量逆流洗涤处理，样品经酶解后总糖得率最大达到45.61%。

图10 不同用水量逆流洗涤后洗液电导率变化Fig.10 Changes of conductivity after countercurrent washing with different water consumption

图11 不同用水量的逆流洗涤对芦苇酶解效果Fig.11 Effect of enzymatic hydrolysis reed after countercurrentwashing with different water consumption

3 结 语

为了解决雄安新区白洋淀芦苇秸秆等废弃物资源高值化利用问题，提出了一种双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇制备可发酵糖的工艺方案，研究了双螺杆挤压处理条件、碱用量、处理温度、时间等过程参数对芦苇酶解的影响，分析了预处理前后芦苇化学组分和纤维结构的变化，得到以下结论。

1)在双螺杆挤压螺纹元件配置为24 mm+22 mm+16 mm+14 mm，螺杆转速为150 r/min，KOH用量为4%、处理温度为90 ℃、保温时间为2 h的条件下，芦苇预处理效果最好，酶解后还原糖产量可达到77.31 g/L，总糖得率比未处理芦苇提高1.64倍。该工艺可用于芦苇生产木质纤维素糖，为规模化生物制造提供原料。

2)双螺杆挤压与碱预处理的耦合导致协同效应，改变了芦苇的纤维结构和化学组分，部分氢键被破坏，部分酯键发生皂化反应，去除了木质素和蜡质等杂质，木质素脱除率达到72%，增加了纤维素酶作用的可及性，提高了酶解效率。

3)预处理后芦苇采用逆流洗涤模式在固液比为1∶8、清洗4次的条件下，使用较低的纤维素酶用量对预处理后的芦苇酶解，总糖得率可达到0.45 g/g干芦苇，该洗涤方法水耗低，还可以有效去除酶解抑制物。

4)预处理后的废液和酶解后的废渣可用于制作富含黄腐酸钾的有机肥[27]，使整个工艺过程不产生废水和废渣，可为白洋淀地区芦苇资源化利用提供一种绿色可行的工业化途径。

双螺杆挤压耦合碱预处理芦苇的方法反应条件适宜，能耗、水耗低，过程无废物排放，酶解效率高，适宜工业化放大应用。但是，关于蜡质和木质素对芦苇酶水解影响的作用机理和预处理后芦苇酶解过程的调控还有待深入分析。因此，未来还需针对芦苇预处理及酶水解过程中的共性规律与调控机制开展进一步的研究。