静电纺丝纳米纤维在牙周再生中的应用

杨梦瑶高现灵邓淑丽

1.浙江大学医学院附属口腔医院牙体牙髓科 浙江大学口腔医学院 浙江省口腔疾病临床医学研究中心浙江省口腔生物医学研究重点实验室 浙江大学癌症研究院 杭州 310006；2.中山大学附属口腔医院牙体牙髓科 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

牙周炎是口腔常见的慢性炎症性疾病，进行性破坏牙齿支持组织（包括牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质），继而导致牙齿的松动和脱落，是成年人失牙的主要原因[1]。牙周治疗的最终目标是修复牙周组织缺损。临床常用的牙周基础治疗和翻瓣手术是控制牙周炎的有效手段，但难以再生牙槽骨、牙骨质以及功能性牙周膜纤维，如何实现牙周组织再生是目前的研究热点和难点。常见的再生技术主要包括引导性组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）和牙周组织工程技术。

GTR利用膜性材料阻止牙龈上皮组织向牙周缺损区生长，为牙槽骨、牙骨质和牙周膜纤维的再生提供一定的空间和时间[2]，以促进牙周组织再生。牙周组织工程技术主要包含支架材料、种子细胞和生长因子三因素，其中支架材料起中心作用，不仅为种子细胞提供合适的生物微环境，还可引导和调控组织再生。理想的GTR膜或组织工程支架应当可以模拟细胞外基质的结构，可招募临近组织中的干细胞，并促进干细胞的增殖和分化[3]。同时，支架/膜应具有优良的生物相容性；具有合适的降解速率，最好与缺损组织再生的速率相匹配；具有一定的机械强度，便于手术操作[4]；具有骨诱导性，可促进干细胞成骨向分化，促进牙槽骨的再生[5]。

大量研究表明，纳米纤维支架/膜具有高比表面积和孔隙率，可通过负载多种活性物质优化生物性能，促进细胞的增殖与分化，已广泛应用于骨、软骨、神经、皮肤、血管等组织再生，也是牙周组织再生中的热门材料。纳米纤维的常用制备方法有自组装法、热致相分离法及静电纺丝技术。静电纺丝是其中可连续制备纳米纤维的方法，同时兼顾经济、简便和高效的优点，并且可以通过调节各种参数控制纤维的直径和排列、孔隙率、降解速率等，从而有针对性地制备符合应用需求的纳米纤维。常规的静电纺丝纳米纤维是膜性材料，适合作为GTR膜[6]；通过添加活性物质提高纳米纤维的成骨性能[7]，或者通过多层纤维叠加[8]和改变制作工艺获得“三维结构”的纤维支架[9]，该材料适用于牙周组织工程。因此，通过静电纺丝技术有望制备理想的GTR膜和组织工程支架材料，本文将对静电纺丝纳米纤维在牙周再生中的应用进行综述。

1 静电纺丝技术概述

静电纺丝装置一般包括：高压电源、溶液储存器、喷射装置和接地的接收装置（平板或旋转的滚筒）。静电纺丝利用高压电场作用使聚合物溶液或熔体带有电荷并产生了电场力，溶液的表面张力与电场力相反，随着外加电压增加至“阈值电压”，即电场力足以克服表面张力，此时液滴被拉长为带电锥体，即“泰勒锥”，喷射流从锥体顶部发出，沿着电场方向加速喷出，经历溶剂挥发、纤维拉伸、沉积和固化，最终纳米纤维落在接收装置上[10]。通过调整静电纺丝的装置可以制备不同结构的纳米纤维，例如，将常规的接收装置改成平行极板接收装置或高速旋转的滚筒，可制备有序排列的纳米纤维；同轴静电纺丝法可制备核-壳结构的纳米纤维；多个喷丝头可制备共纺的纳米纤维等。

静电纺丝纳米纤维的形态和性能受很多因素的影响，主要分为系统参数和工艺参数[10]。系统参数包括聚合物分子量、浓度、粘度、表面张力、溶剂等，工艺参数包括喷丝头直径、电纺溶液流速、电压、喷丝头到接收板的距离等。另外湿度、温度、风速也会影响静电纺丝的过程。因此，学者们尝试通过改变各种参数在纳米尺度精细地调控纤维的微观形貌，从而获得趋于理想的纳米纤维。

2 静电纺丝纳米纤维在牙周再生中的应用研究

静电纺丝的基质包括天然高分子、合成高分子及各种复合材料。理论上来说，对于各类高分子材料，只要找到合适的溶剂体系，均可利用静电纺丝技术获得纳米纤维。还可以通过负载多种活性物质优化纳米纤维的生物活性，从而调节细胞生长的微环境，促进细胞的增殖分化。除此之外，纤维结构的构建也至关重要，三维仿生的支架可作为模板引导和调控组织再生。以下将从静电纺丝纳米纤维的基质成分、生物活性和微观结构三方面进行阐述。

2.1 基质成分

静电纺丝的基质成分主要包括天然高分子材料、合成高分子材料以及二者的复合。

天然高分子材料，如壳聚糖（chitosan，CS）、细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）、明胶（gelatin，GEL）、胶原蛋白（collagen，COL）、丝素蛋白（silk fibroin，SF）、玉米醇溶蛋白含较多调控细胞行为的活性基团，生物相容性佳且易于从自然界获取。但由于此类材料普遍缺乏机械稳定性，可纺性较差，用于牙周再生的纯天然静电纺丝纳米纤维较少。

常用的合成高分子聚合物包括聚已酸内酯（poly-caprolactone，PCL）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（poly lactic acid，PLA）、聚乳酸-羟基乙酸（polylactic acid-glycolic acid，PLGA）共聚物、聚氧化乙烯（polyethylene oxide，PEO）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 和 聚 乙 烯 醇 （polyvinyl alcohol，PVA）等。PCL价格低廉、可纺性强、生物相容性佳，是骨组织工程常用的支架材料。相较于PCL，PGA具有优秀的生物相容性和较快的水解速率。PLA与细胞的亲和力较弱，且降解速率较慢，为了提高PLA的亲水性和降解速率，学者们[11]将乙醇酸引入PLA链中构建了PLGA。PEO具有亲水性和生物相容性，并且能增加聚合物溶液的粘度和导电性。PVP[12]、PVA[13]常作核—壳结构的核心纤维，用于药物缓释系统。

由于合成高分子材料可纺性强，机械性能好，但缺少促进细胞黏附、增殖、分化的活性基团，而天然高分子材料通常生物活性较优但力学强度较差，目前研究者们倾向于利用共纺、同轴电纺、表面涂层修饰等方式复合使用合成高分子及天然高分子材料。PCL中加入CS[14]，GEL[15]、COL[16]等能显著地降低纳米纤维的疏水性，增加细胞的黏附。Shen等[17]在PLA中添加CS进行静电纺丝，发现PLA-CS纤维的亲水性能增加，并可促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在纤维上增殖和成骨向分化。PLGA复合多壁碳纳米管和BC可增加支架的骨诱导性，促进牙周再生[18]。PLGA虽为合成高分子，但力学性能较差，Jia等[19]发现，加入可溶性蛋壳膜蛋白可增加PLGA的可纺性和力学强度。

2.2 优化生物活性

用于牙周组织再生理想的纳米纤维应具有促进细胞黏附、促成骨、抗炎、抗菌等性能，大量研究表明将不同的生物活性物质负载在纳米纤维上可优化材料的生物性能，促进牙周组织再生（表1）。

表1 优化生物活性的各种静电纺丝纳米纤维Tab 1 Various electrospun nanofibers with optimized biological activity

2.2.1 生物陶瓷 骨基质的主要成分为有机胶原纤维和羟磷灰石，生物陶瓷材料如羟磷灰石纳米颗粒 （hydroxyapatite nanoparticle，nHAp） 和β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）被添加到静电纺丝材料中，使材料具有良好的生物活性和骨传导性，可促进牙周和骨组织的修复再生。

研究[20-22]证实，在静电纺丝基质中加入nHAp进行混纺，可以改善其力学性能，促进成骨细胞的增殖和矿化。nHAp含量越高，支架促成骨效果越明显，但含量过高时，nHAp的脆性可能导致纺丝过程中纤维断裂，支架的拉伸强度降低。除此之外，还可以通过仿生矿化法制备纳米纤维的HA涂层。主要的仿生矿化法有仿生浸泡法、机械化学法、共沉淀法及分子自组装法。Lai等[23]研究发现，nHAp以混纺方式位于CS/SF纤维内或者以涂层形式（仿生浸泡法）位于纤维表面，均能提高材料的骨引导性，但经涂层修饰的支架力学性能显著降低。不过，也有学者[24]采用化学沉淀法制备纤维表面的nHAp涂层，结果表明该材料具有良好的物理化学性能，这可能是使用不同仿生矿化法的原因。总体来说，HA涂层的厚度和均匀性较难控制，结合强度也往往不够理想，距离临床应用还有距离。

β-TCP被植入人体后，其降解出的钙和磷能进入活体循环系统有利于新生骨的形成，是牙周骨组织理想的替代材料[7,25]。有学者[26]通过静电纺丝的方法将不同含量的β-TCP加到聚癸二酸甘油酯（polyglycerol sebacate，PGS）/PCL纤维中，结果表明含10% β-TCP的纤维具有良好的力学性能，可促进细胞增殖和碱性磷酸酶活性。Chen等[6]制备了PLA/β-TCP纤维作为GTR膜，经小型猪牙周缺损实验证实，PLA/β-TCP纤维可促进牙骨质和牙槽骨的新生；值得一提的是，临床实验结果表明，实验组患者在GTR术后6月较术前牙周探诊深度降低、牙周附着水平提升，表明该材料有广阔的应用前景。

2.2.2 药物 牙周炎症的发生及进展与牙周致病菌关系密切，负载抗菌、抗炎药物的纳米纤维可作为药物缓释系统，长时间平稳地释放药物，促进牙周组织再生。常规的载药方式是将牙周药物和基质溶于电纺溶剂中进行纺丝，药物在溶剂中的溶解度、药物与基质的相容性是关键；同轴静电纺丝法可以合成核-壳结构纳米纤维，药物与核心高聚物掺杂，多孔的外壳允许核心降解和释放分子，加强对牙周药物的保护作用及缓释效果，载药效果较佳。学者们尝试在纳米纤维中添加多种抗菌药物，比如甲硝唑[27-28]、阿莫西林[29]、盐酸四环素[30]、盐酸强力霉素[31]和替尼唑[32]等，用于抑制牙周病原菌的生存。也有学者将非甾体抗炎药用于静电纺丝，如阿司匹林[33]、布洛芬[34]和吡罗西康[35]，此类药物可以抑制环氧化酶的活性，减少前列腺素的生成，从而抑制炎症反应。另外植物提取物，如姜黄素、芹黄素、绿茶多酚、毛紫檀等具有抗炎、抗氧化等作用，也可被负载在电纺纤维中用于骨再生[36-37]。除了抗菌、抗炎药物，辛伐他汀[38-39]、地塞米松[40-41]、雷尼酸锶[13]对调节分子和细胞水平的骨再生过程具有多效性。因此，有学者制备相关的纳米纤维促进骨再生，但还需要更多的体内外实验确认其疗效。

2.2.3 金属及金属氧化物 由于使用抗生素药物存在细菌耐药性的问题，并且可能对人体细胞造成潜在的毒性，因此学者们尝试在静电纺丝中添加金属及金属氧化物来提升纤维的抗菌性能。研究[42]表明，将银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）加入到纳米纤维中可提高膜的抗菌活性。有学者[4]将AgNPs和nHAp添加至PLA纤维中，结果证实，1%~2%的AgNPs能显著抑制粪肠球菌和大肠杆菌，且抑菌作用在32 d内随时间增加而加强。除了AgNPs可优化材料性能外，金纳米颗粒（gold nanoparticles， AuNPs） 和 金 属 锶 （strontium，Sr）可能具有提高材料骨诱导性能的潜力。研究[43-44]表明，在纳米纤维中的AuNPs 可通过MAPK信号通路促进hPDLSCs向成骨细胞分化，但同等条件下AuNPs的骨诱导性能不如β-TCP[45]；使用Sr离子替代HA中的部分钙离子，可促进人成骨肉瘤细胞MG63成骨向分化[46]。

另外，有学者[47]将CaO、ZnO纳米颗粒加入PCL基质中进行纺丝，发现加入CaO降低了材料的力学性能，但能促进MC3T3-E1成骨向分化；PCL纤维中加入ZnO，可使PDLSCs的活力、矿化能力和成骨相关基因表达增强，且纤维可抑制牙龈卟啉单胞菌生长[48]。另外有研究[49]表明，聚醚醚酮纳米纤维中添加胺基化的ZrO2纳米颗粒可增强材料的强度和生物相容性。但目前针对上述金属及金属氧化物的体内研究较少，其安全性、抗菌活性和促成骨功效还需进一步探索。

2.2.4 蛋白质 牙周组织再生中，辅助适当的生长因子可以调控干细胞的生长与分化，由于直接使用生长因子存在浓度低、活性时间短的问题，核-壳结构的纳米纤维在一定程度能起到控释生长因子的作用，是负载生长因子常用的载体材料。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是正常骨骼愈合过程中成骨和成血管的有效诱导剂，负载BMP的纳米纤维可以促进骨重建[50-51]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）[52]和富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）中含有大量高浓度的细胞生长因子，主要为血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）[28]、转化生长因子 （transforming growth factor，TGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）[53]，在创伤愈合和骨再生中起重要作用。近年来，考虑到血管再生对于成功的骨再生十分关键，静脉内皮生长因子（endothelial growth factor，VEGF）也被尝试负载在纳米纤维上，用于促进骨缺损区的血管再生[54-55]。

除生长因子外，功能蛋白在提高材料的生物学性能和抗菌性方面也具有广阔的前景。纤连蛋白（fibronectin，FN）是一种配体-整合素亲和蛋白，可以聚集相邻细胞和促进细胞的识别。Campos等[56]在水解的PLGA纤维上包被一层FN，结果证实，纤维的亲水性和细胞黏附能力显著增加。骨钙素（osteocalcin，OCN）是骨基质中最丰富的非胶原蛋白，参与骨修复和再生的后期阶段，有研究[57]用FN和OCN的融合蛋白修饰PCL/GEL纳米纤维表面，可促进MSC的黏附增殖，同时促进支架表面的矿化。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有广谱的抗菌活性。有学者[58]将载AMP的PLGA微球加入到GEL/CS/nHAp纳米纤维中，该材料可在1个月内抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。目前，国外PDGF已被批准用于临床，大多数生长因子和功能蛋白的应用还处于研究阶段，需要更多临床前和临床实验确定其疗效；大多数研究中纳米纤维只负载一种生长因子，未来可以尝试负载2种或更多的生长因子，因此探索合适的生长因子组合可能是提升纳米纤维活性的一种新策略。

2.2.5 新型碳纳米材料 氧化石墨烯（graphene oxide，GO） 和多壁碳纳米管 （multiwall carbon nanotubes，MWCNTs）由于优异的机械性能和生物相容性被广泛应用于骨组织再生领域。GO具有促进干细胞成骨向分化的功能，可用于骨组织再生[59-60]。Zhou等[61]在静电纺丝基质中入GO，结果表明，GO可以提高纳米纤维的拉伸强度和杨氏模量，促进体内骨再生。但关于GO用于牙周组织再生的研究较少，需要开展更多的实验进行探索。

纳米纤维中加入MWCNT能显著地提升纤维的强度和韧性[62-63]，除此之外，MWCNTs具有骨传导性，可以上调骨分化相关基因并促进细胞矿化[9]。有学者[18]以真空冷冻干燥得到的BC膜为下层，上层收集PLGA/MWCNTs纳米纤维，从而制备了三维网状结构的PLGA/MWCNTs/BC复合支架，结果显示，该支架能促进比格犬上颌牙周缺损区牙槽骨的新生。GO和MWCNTs在体内不能有效降解，限制了此类材料的实际应用，需要进一步验证其生物安全性，并探索可促进其降解的生物酶或改性方法。

2.3 微观结构

理想的支架/膜应当能在纳米尺度模拟细胞外基质的结构，作为模板引导和调控组织再生。已有大量研究表明，纳米纤维的直径、孔隙率、表面刚度和排列方向等对细胞的行为有很大的影响。

2.3.1 纤维直径 静电纳米纤维的纤维长而连续，当直径为50~500 nm时，其结构更接近于细胞外基质，有利于细胞的黏附和增殖。研究[64]表明，纤维直径也影响着单根纤维的刚度，当纤维直径小于700 nm时，纤维的结晶度增加，从而弹性模量增加，反之当纤维直径较大时，纤维内部结构可能较为混乱，从而弹性模量较低。纤维的直径影响纤维的刚度，从而可能进一步影响细胞在纤维上迁移、增殖和分化，明确三者间的联系将有助于纤维支架/膜的设计与构造，但目前尚缺乏相关的研究。

2.3.2 纤维孔隙率 静电纺丝纳米纤维的孔径大小直接影响细胞的黏附和渗透、营养物质的运输、代谢产物的清除和血管化等，是决定材料性能的关键因素。当孔径大于单个细胞大小时，细胞将沿着单条纤维生长，且更容易渗入支架/膜中；当孔径较小时，细胞倾向于跨越孔隙与不同纤维形成多个接触点[65]，而孔径足够小时，细胞也难以通过形变而“挤过”孔隙。纳米纤维的孔径通常为1 μm，远小于成纤维细胞的直径[66]。因此，作为GTR膜可阻挡牙龈上皮细胞向骨缺损处迁移。在组织工程中，纳米纤维支架与牙周骨缺损区接触的一面往往需要负载干细胞以促进骨再生，而小孔径的纤维支架限制了细胞的浸润，因此可以考虑将静电纺丝技术与冻干、三维打印技术结合，构建双面孔径不同的复合支架，以更好地适应牙周再生的需求。

2.3.3 纤维取向 静电纺丝中通过控制接收装置可获得有序或无序的纳米纤维。有序的纳米纤维走向基本一致，可引导细胞沿纤维走向排列，并促进细胞分泌基质；无序的纳米纤维杂乱无序，生长的细胞也呈现散乱分布的状态[67]。已有研究将有序的纳米纤维应用于排列高度一致的组织的新生，如骨膜、神经、肌腱等组织。而牙周膜中的胶原纤维以定向排列的形式插入并锚定在牙槽骨和牙骨质的矿化表面，有序的纳米纤维有望引导牙周膜纤维再生。体内实验证实，利用有序的PLGA/GEL纳米纤维膜引导PDL再生，在小型猪下颌新生的骨组织和牙骨质间能观察到明显的PDL样组织[68]。考虑到牙周膜组织是宽度为100~350 μm的致密结缔组织，研究人员尝试构建能够更好地模拟天然PDL结构的三维有序支架[8,69]。Jiang等[69]将多层有序的聚己内酯-聚乙二醇纤维通过多孔壳聚糖联合，获得三维有序的支架，用于引导大鼠牙周缺损区牙周膜纤维的有序再生。结果表明，新生的PDL样纤维规则有序，类似天然PDL的排列，并且高表达I型胶原和骨膜蛋白。然而，牙周膜组织结构精密，5组主纤维束的方向各异、层次复杂，目前的三维有序支架在结构精度上有所欠缺，如何提高支架的结构精度和仿生程度值得进一步研究。

3 结语与展望

静电纺丝技术在牙周再生方面具有明显优势，是制备GTR膜和牙周组织工程支架的有效方法。但现有的研究大多局限在体外实验和少量动物实验，需要进行更多的体内实验和临床转化研究，距离临床应用还有一定距离。另外，目前尚未获得完全理想的材料，既能匹配缺损组织的再生速率，又具有抗炎作用，能促进类似天然“牙骨质—牙周膜—牙槽骨”结构的组织的新生，因此根据临床需要，探索合适比例的理想材料和优化静电纺丝工艺参数至关重要，需要进一步探索和研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。