高乳化稳定性小米淀粉Pickering乳液的制备

于 博，陆兰芳，余海忠，汤尚文，豁银强，吴进菊，闫 毅

（1.湖北文理学院食品科学技术学院，湖北 襄阳 441053；2.襄阳三珍食品有限公司，湖北 襄阳 441053）

Pickering 乳液是固体颗粒稳定的乳液，其显著优点在于体系中无表面活性剂成分，不仅不会像传统乳液因含表面活性成分出现皮肤刺激、溶血行为或环境污染等问题，而且在抗聚结合和奥斯特瓦尔德熟化上表现出更强的稳定性[1-5]。淀粉颗粒是自然界大量存在的多糖分子，不仅来源广泛，而且具有良好的生物降解性、安全稳定性、环境相容性等突出优点，淀粉颗粒稳定Pickering 乳液的研究近年来受到了国内外学者越来越多的关注[6-7]。影响淀粉颗粒稳定Pickering 乳液的因素较多，就淀粉本身而言，主要是淀粉颗粒的粒径大小和颗粒表面的润湿特性。不同来源淀粉因粒径、直链/支链淀粉比例、颗粒表面形状、结晶结构、电位等差异，导致淀粉颗粒形成Pickering 乳液能力、稳定Pickering 乳液能力各不相同。一般来说，小颗粒淀粉在形成和稳定Pickering 乳液上表现更好；但是，由于自身组成的多羟基结构，天然淀粉的乳化稳定性较差，常采用疏水改性方法改善淀粉颗粒的润湿特性。辛烯基琥珀酸酸酐是最常用的疏水改性试剂之一，通过酯化反应在淀粉分子中接枝疏水性长烯基链，增大了淀粉颗粒在油/水界面的空间位阻，比原淀粉表现出更好的乳化性，在淀粉基O/W 型Pickering 乳液及功能因子递送体系中应用前景广阔[8-11]。目前，研究主要聚焦于各种预处理包括湿热、酸解、热碱等[12-14]或制备过程辅助手段包括挤压、超声、球磨等[15-17]来提高疏水改性效率和制品两相界面亲和特性。

小米淀粉是小米的主要成分，占小米质量分数62.8%～70.5%，是一种低成本、易获取、可持续且未充分利用的淀粉资源。小米淀粉颗粒大小约为6～12 μm，属于小粒淀粉，而且淀粉颗粒表面存在孔隙和凹痕，这有助于分子修饰、消化等靶向反应，能够拓展小米淀粉的应用范围。本团队前期研究发现，辛烯基琥珀酸改性的小米淀粉在Pickering 乳液体系有较好的乳化效果，但是储存一段时间后会出现相分离现象[18]。为提高辛烯基琥珀酸小米淀粉（以下简称OSA 小米淀粉）制备效率，并进一步提高其乳化能力和乳化稳定性，作者采用超声处理技术改变小米淀粉结构，研究超声对小米淀粉酯化反应效率、取代度及取代基团分布的影响；采用球磨处理技术改善OSA 小米淀粉结构，研究球磨对OSA 小米淀粉微观形貌、结晶结构、乳化能力及稳定性的影响，为小米淀粉颗粒形成更加稳定的Pickering 乳液提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米淀粉：作者所在实验室自制；辛烯基琥珀酸酐（OSA）：阿拉丁生化科技股份有限公司产品；中链甘油三酯（MCT）：上海源叶生物科技有限公司产品；氢氧化钠、盐酸、硫酸、溴化钾、苯酚、乙醇等：均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

JY88-IIN 超声波细胞粉碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；Emax 高能球磨仪（含控温功能）：德国Retsch 责任有限公司产品；S-4800 型扫描电子显微镜：日本Hitachi 公司产品；D8 Advance X 射线衍射仪：德国Bruker 公司产品；Malvern3000 激光粒度仪：英国Malvern 公司产品；Nexus470 傅立叶红外变换光谱仪：美国Thermo Nicolet 公司产品；IKA T18 高速分散机：德国IKA 仪器设备有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 超声辅助OSA 小米淀粉的制备小米淀粉配置成20 g/dL 淀粉乳，置于超声细胞破碎仪，超声功率0、25、50、100、150、200、250 W，时间40 min，每次超声作用5 s、间隔5 s，超声后抽滤洗涤，40 ℃烘干后备用。以超声预处理的小米淀粉为原料，配制35 g/dL 淀粉乳，在1 h 内滴加淀粉干基3 倍的OSA（95%乙醇稀释5 倍），控制体系pH 8.5、温度35 ℃。反应完成后，调节pH 至6.5 左右，用70%乙醇和蒸馏水分别离心洗涤2 次后，40 ℃鼓风干燥，研磨过100 目筛，得到OSA 小米淀粉。

1.3.2 取代度及反应效率的测定称取1.5 g OSA小米淀粉，加入50 mL 体积分数95%乙醇溶液磁力搅拌10 min，再加入15 mL 2.0 mol/L 的盐酸-乙醇溶液酸化处理30 min，用体积分数90%乙醇抽滤洗涤至无Cl-为止，再将样品移入锥形瓶中，加100 mL去离子水，沸水浴20 min 后取出，趁热用0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴至粉红色，以酚酞做指示剂[19-20]。取代度 （Degree of Substitution，DS）和反应效率（Reaction Efficiency，RE）见式（1）～（2）。

式中：c为NaOH 标准溶液浓度，0.1 mol/L；V为滴定消耗NaOH 体积，mL；W为OSA 小米淀粉质量，g；DS 为取代度、DS实际为实际取代度、DS理论为理论取代度；RE 为反应效率。

1.3.3 OSA 小米淀粉的酸水解称取OSA 小米淀粉100 g，用体积分数5%盐酸溶液配制质量浓度为40 g/dL 淀粉乳（1.0 g 淀粉/1.27 mL 盐酸），置于55℃恒温振荡水浴中酸水解不同时间后，碱中和反应并离心处理，去离子水抽滤洗涤干净，至pH 6 左右，40 ℃恒温干燥24 h 后过100 目标准筛备用。采用文献[21]的方法，测定OSA 小米淀粉水解度。

1.3.4 结晶结构分析采用X 射线衍射仪测定OSA 小米淀粉系列样品的结晶结构。测试参数：铜靶，管电压和电流分别为40 kV 和30 mA，扫描速率为8°/min，扫描范围为3°～40°（2θ），步长0.02°。用JADE6.0 软件分析并计算相对结晶度。

1.3.5 特征官能团分析采用傅立叶红外光谱仪测定OSA 小米淀粉系列样品的特征官能团。取少量OSA 小米淀粉样品和溴化钾（质量比约为1∶100）置于红外灯下研磨混匀，压片后用傅立叶红外光谱仪扫描，扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描32 次，分辨率为4 cm-1。

1.3.6 球磨处理球磨转速400 r/min，控制球磨温度25～32 ℃，球磨处理0.25、0.5、1、2、3 h。球磨OSA小米淀粉置于4 000 r/min 离心15 min，冷冻干燥24 h，过100 目筛制得球磨OSA 小米淀粉。

1.3.7 微观形貌分析采用电子扫描显微镜观察球磨OSA 小米淀粉的微观形貌。取适量球磨OSA小米淀粉样品均匀涂布于扫描电子显微镜载物台上，真空喷金后送入样品室，在不同放大倍数下进行观察。

1.3.8 Pickering 乳液的制备用蒸馏水配制不同质量浓度（1.0、1.5、2.5、3.5、5.0 g/dL）的球磨OSA 小米淀粉分散液，以MCT 为油相，油相比例50%。将球磨OSA 小米淀粉分散液与油相预混合，再用高速分散机20 000 r/min 均质2 min，分4 次进行，每次作用30 s，间隔60 s。

1.3.9 Pickering 乳液粒径的测定采用MS3000 激光粒度分析仪测定乳液粒径，以体积粒度D4，3 表示乳液平均粒径，D3，2 为表面积平均粒径，参数设置为样品折光率1.450、水折光率1.333、吸光值0.001、循环水转速2 400 r/min。

1.3.10 Pickering 乳液乳化指数的测定将乳液于25 ℃环境静置储存，观察乳液相分离情况，记录乳液乳化指数，见式（3）。

式中：ESI 为乳化指数；VE为乳液的乳化层体积，mL；VT为乳液总体积，mL。

1.3.11 数据处理每个实验重复3 次，使用SPSS 22 软件数据统计并进行显著性分析（P＜0.05）；采用Origin 9.0 绘制图。

2 结果与分析

2.1 超声对小米淀粉酯化反应的影响

不同功率超声处理对小米淀粉酯化反应的影响见图1。未经过超声处理的小米淀粉制备OSA 小米淀粉时，反应4 h 后体系pH 不再发生变化，达到平衡状态，此时OSA 小米淀粉取代度为0.016 6。超声处理小米淀粉后，随着超声功率的增加，OSA 小米淀粉取代度及反应效率随之增大，反应时间明显缩短。250 W 超声处理的小米淀粉，在酯化反应2.5 h 后达到平衡，取代度达到0.021 8，接近理论取代度0.023 1，反应效率从71.62%增大到94.22%，相比未超声处理制备的OSA 小米淀粉取代度提高了32%。这主要是因为在小米淀粉与辛烯基琥珀酸酐（OSA）反应时，由于溶解性差异以及淀粉结构的复杂性，酯化反应主要集中在小米淀粉颗粒表面，OSA在小米淀粉颗粒上的分布并不均匀；而超声空化和机械作用破坏了小米淀粉颗粒的聚集态结构及形态，内部结构变得疏松，颗粒表面出现更多空隙和凹槽，比表面积增大，同时暴露出了更多酯化反应的位点，这与Chen、Hu 研究结果一致[22-23]。也有研究表明，超声可能会导致少量小米淀粉的降解，产生的直链淀粉也有助于酯化反应的进行，从而提高了酯化反应的效率和取代度[24-25]。

图1 超声功率对OSA 小米淀粉取代度及反应效率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on the degree of starch substitution and reaction efficiency of OSA millet

2.2 OSA 小米淀粉的取代基团分布

取代基团在淀粉颗粒的分布情况与淀粉乳化能力及稳定性有关。为探究取代基团在小米淀粉颗粒上的分布情况，采用盐酸水解方法进行研究。酸解过程中OSA 小米淀粉取代度、水解度与酸解时间的关系见图2。由图2可知，随着酸解时间的延长，3种OSA 小米淀粉水解度均较大程度增大，且变化速率相近，说明酸水解对非结晶区的破坏速度相近，8 h 后水解度趋于平稳。3 种OSA 小米淀粉取代度均较大程度下降，与未超声制备OSA 小米淀粉相比，2种超声制备的OSA 小米淀粉取代度下降趋势相近，经过2 h 酸水解后取代度急剧下降，然后趋于缓慢，在8 h 后趋于平缓，未超声制备OSA 小米淀粉经水解后取代度下降趋势相对缓慢。由于酯化反应时OSA 基团主要分布在淀粉颗粒无定形区，因此推测酸水解优先发生在无定形区域，破坏了该区域中接枝的OSA 基团，取代度下降明显。随着酸水解反应的不断进行，无定形区接枝的OSA 越来越少，当酸水解12 h 时，3 种OSA 小米淀粉水解度趋于一致，但OSA 基团含量分别是250 W 超声制备OSA 小米淀粉最多、150 W 超声制备OSA 小米淀粉次之、未超声制备OSA 小米淀粉最少，这说明随着超声功率的增加，更多OSA 基团进入了小米淀粉的结晶区域。

图2 酸水解时间对OSA 小米淀粉取代度及水解度的影响Fig.2 Effects of acid hydrolysis time on degree of substitution and hydrolysis rate of OSA millet starch

2.3 OSA 小米淀粉的结晶结构与特征官能团变化

图3是OSA 小米淀粉经过不同时间酸水解后的X 射线衍射图谱，由图3可知，不同水解度的OSA 小米淀粉均保持了典型的A 型淀粉衍射图谱，在15°、17°、18°、23°有明显的衍射峰，且17°和18°处呈肩峰[26]。水解度为0 的OSA 小米淀粉和不同水解度的OSA 小米淀粉都保持了原有的晶体结构，这说明酸水解并未改变淀粉颗粒的晶型结构，上述试验中被破坏的OSA 基团主要分布在无定形区域。

图3 不同水解度OSA 小米淀粉的X 射线衍射图谱Fig.3 X ray diffraction patterns of OSA millet starch with different degrees of hydrolysis

用傅立叶红外光谱表征OSA 小米淀粉酸水解后的特征官能团结构变化，见图4。由图4可知，不同水解度OSA 小米淀粉的红外光谱特征吸收峰基本保持不变。3 300～3 800 cm-1区域有较大吸收峰，来源于O—H 伸缩振动；993 cm-1处出现深特征带，表明存在α-1，4 糖苷键和C—O—C 伸展；2 900 cm-1附近吸收峰与C—H 伸展振动有关；1 640 cm-1处的吸收峰与淀粉分子中的结合水有关；1 724 cm-1是酯类物质C=O 伸缩振动特征峰，表明小米淀粉分子上仍然存在OSA 官能团；1 570 cm-1处出现的特征峰对应于RCOO-的不对称伸缩振动，这是由于小米淀粉与辛烯基琥珀酸酐在碱性条件下反应后以辛烯基琥珀酸淀粉钠的形式存在。在水解度达20.83%时，酯类物质C=O 伸缩振动特征峰仍非常明显，随着水解度继续增大，1 724 cm-1处的酯键吸收峰略微减弱，但并未完全消失。这也说明小米淀粉颗粒经过超声处理产生的裂缝和孔隙有助于OSA 进入淀粉颗粒的内部，接近结晶区域或者水解不易达到的区域。

图4 不同水解度OSA 小米淀粉的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of OSA millet starch with different degrees of hydrolysis

2.4 球磨对OSA 小米淀粉微观形貌的影响

球磨前后OSA 小米淀粉的微观形貌见图5。由图5可知，未经球磨处理OSA 小米淀粉呈多面体形，颗粒完整、棱角分明，表面相对光滑，与原小米淀粉微观形貌基本一致[27]。球磨0.25 h 的OSA 小米淀粉仍保持颗粒结构，但可观察到淀粉颗粒开始出现轻微的变形，淀粉颗粒表面出现褶皱凹陷。球磨0.5 h 后，部分淀粉颗粒出现崩解现象，严重崩解的颗粒失去了多面体形态。随着球磨时间的延长，淀粉颗粒经过反复摩擦、剪切，表面破损严重，颗粒棱角逐渐模糊，部分淀粉颗粒崩解，溶胀的淀粉颗粒黏结成不规则的团块。球磨2 h 后，淀粉颗粒的形态完全改变，颗粒表面变得粗糙且呈现不规则的块状分布，导致OSA 小米淀粉的界面吸附性增加。

图5 不同球磨时间OSA 小米淀粉扫描电镜图（1 000×和3 000×）Fig.5 SEM of OSA millet starch prepared through different ball-milling time（1 000× and 3 000×）

2.5 球磨对OSA 小米淀粉结晶结构的影响

球磨前后OSA 小米淀粉的X 射线衍射图见图6。由图6可知，球磨前后OSA 小米淀粉与原小米淀粉晶体结构类似，都是A 型晶体结构，球磨处理并未改变OSA 小米淀粉的晶体类型。随着球磨的进行，OSA 小米淀粉的特征衍射峰强度逐渐减弱，逐渐由尖峰衍射变为弥散峰衍射，这主要是因为球磨产生的机械撞击、剪切和摩擦作用破坏了维持淀粉结晶结构稳定的支链淀粉侧链团簇间的氢键，晶体变形和晶格缺失导致相对结晶度由最初的33.00%降低到球磨0.25 h 的27.60%，直至降低到球磨1 h的19.84%，结晶结构趋于稳定。

图6 不同球磨时间OSA 小米淀粉的X 射线衍射图谱Fig.6 X ray diffractograms of OSA millet starch prepared through different ball-milling times

2.6 球磨对OSA 小米淀粉Pickering 乳液的影响

乳液粒径是乳化性能的重要指标，图7显示了球磨时间与样品乳液平均粒径和储存7 d 乳化指数的关系。从图7可以看出，乳液平均粒径大小随OSA 小米淀粉球磨时间的延长呈现先增大后减小的趋势，乳液平均粒径从未球磨OSA 小米淀粉的41.20 μm 增大到球磨0.5 h OSA 小米淀粉的66.60 μm，表明短时间球磨处理对OSA 小米淀粉乳化能力是不利的。随球磨时间延长至1 h，乳液平均粒径开始降低；球磨2 h 后OSA 小米淀粉制备的Pickering 乳液平均粒径降低到最低值24.50 μm，较未球磨样品降低了约41%，表明长时间的球磨可有效改善OSA 小米淀粉的乳化能力，这主要是由于球磨处理导致界面吸附性增加和结晶结构的破坏。乳液平均粒径的降低也有利于小米淀粉颗粒在界面的吸附和有序排列，从而表现出更加优良乳化能力和稳定性。

图7 球磨时间对OSA 小米淀粉Pickering 乳液的影响Fig.7 Effects of ball-milling times on Pickering emulsion stabilized by OSA millet starch

2.7 球磨OSA 小米淀粉质量浓度对其Pickering乳液的影响

淀粉颗粒质量浓度与Pickering 乳液稳定性密切相关。表1是球磨OSA 小米淀粉质量浓度与Pickering 乳液储存稳定性的关系。由表1可以看出，不同颗粒质量浓度的Pickering 乳液在6 h 后呈现出不同的乳化效果，放置1 d 后乳化趋于稳定。当OSA 小米淀粉质量浓度为1 g/dL 时，6 h 后的乳化指数为74%；1 d 后乳化指数稳定在70%，与其他质量浓度形成的Pickering 乳液相比，分层现象最严重；随着球磨OSA 小米淀粉质量浓度的增加，Pickering 乳液乳化层体积逐渐增加，分层现象逐渐减弱，乳化指数不断增大。颗粒质量浓度增大到3.5 g/dL 时，乳化相体积达最大值，7 d 后乳化指数仍保持在99%，表明乳液稳定性处于很好的状态。

表1 球磨OSA 小米淀粉添加质量分数对Pickering 乳液稳定性的影响Table 1 Effects of ball-milled OSA millet starch addition on the stability of Pickering emulsion

表2是球磨OSA 小米淀粉质量浓度与Pickering 乳液粒径分布的关系。由表2可以看出，随着淀粉颗粒质量浓度的增加，Pickering 乳液平均粒径和表面积平均粒径呈降低趋势。当颗粒质量浓度为1.0 g/dL 时，乳液平均粒径为244 μm，由于此时粒径较大，淀粉颗粒难以在油滴表面形成致密完整的吸附层，两相界面强度不高，液滴在碰撞时容易絮凝形成大油滴，这正是1 g/dL OSA 小米淀粉形成Pickering 乳液能力和乳化稳定性不足的原因。颗粒质量浓度为3.5 g/dL 的乳液平均粒径为48.6 μm，约为1 g/dL 的乳液平均粒径的20%。此时由于更多的小米淀粉颗粒吸附在油/水界面上，通过毛细管力有序排列，形成较为致密的界面颗粒膜，阻止乳液液滴间相互聚结，这也是3.5 g/dL OSA 小米淀粉形成Pickering 乳液能力和乳化稳定性良好的原因。

表2 球磨OSA 小米淀粉添加质量分数对Pickering 乳液粒径的影响Table 2 Effect of ball-milled OSA millet starch addition on the particle size of Pickering emulsion

3 结 语

在超声-球磨辅助制备辛烯基琥珀酸小米淀粉酯的过程中，超声处理不仅提高了OSA 小米淀粉的制备效率，而且提高了有助于乳化的酯化基团取代度；球磨处理通过改变颗粒微观形态和晶体结构，降低了OSA 小米淀粉所形成的Pickering 乳液粒径，增强了小米淀粉颗粒在油水界面的吸附能力，从而赋予了小米淀粉颗粒更加优良的乳化能力和乳化稳定性。超声、酯化和球磨联用的复合改性技术是提高小米淀粉稳定Pickering 乳液的有效方法，未来可深入探讨复杂食品体系对小米淀粉Pickering 乳液的影响因素和机制，为拓展小米淀粉应用场景提供更多理论和实践依据。