人工养殖南美白对虾中副溶血弧菌的分离鉴定及抗生素耐药性分析

李小玥，姚槐应，葛超荣

武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205

南美白对虾，又称凡纳滨对虾，具有产量高、味道鲜美、营养价值丰富等特点，自从引入我国后迅速发展成我国第一大海水养殖虾种。2019年我国海水养殖南美白对虾产量为1 144 370 t，占海水养殖虾类总产量的78.91%［1］。副溶血弧菌是南美白对虾养殖中常见的致病菌，是导致虾类早期死亡综合征（又称急性肝胰腺坏死病，acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS）的病原菌，AHPNS爆发会对南美白对虾养殖业造成巨大经济损失。此外，副溶血弧菌也是一种人、渔共致病的病原菌，进入人体后会引起食源性中毒和急性腹泻［2］。

作为杀死或抑制细菌生长的化学药品，抗生素在水产养殖中被广泛使用。2017全球水产养殖中使用的抗生素约为10 259 t，而中国的水产养殖抗生素消费量占比为57.9%［3］。长期大量甚至过度使用抗生素导致养殖水体中抗生素残留。在一项有关中国海岸线的近海水样的研究中，13种目标抗生素中有7种被检测出，抗生素总浓度为389～3 302.3 ng/L［4］。抗生素的残留会导致对虾养殖环境中耐药细菌甚至多重耐药菌的富集。渤海、黄海及东海沿岸的山东省和浙江省是我国重要的海水养殖区域。2012年从青岛海水养殖虾中分离的副溶血弧菌对18种目标抗生素中的3种高度耐药，少量菌株表现出多重耐药性［5］。2017年至2019年从浙江省养殖的南美白对虾中分离出的副溶血弧菌，对氨苄西林和链霉素的耐药率较高，多重耐药菌株也比较常见［6］。虽然这两地有部分报道，但是并没有细致到青岛、宁波两地养殖南美白对虾中分离的副溶血弧菌耐药性的报道。有关黄河入海口的东营附近养殖南美白对虾中副溶血弧菌耐药情况暂未见报道。

本研究从宁波、青岛和东营三个地区的养殖南美白对虾中分离副溶血弧菌，测定分离菌株的耐药情况，分析这些养殖区域的副溶血弧菌的耐药情况形成的原因和如何减少其耐药性。

1 实验部分

1.1 材料与化学试剂

1.1.1 实验材料本实验室于2020年9月从浙江、山东的市场购买当地养殖南美白对虾，虾体成熟健康且大小均匀，每只约重16 g。-40℃速冻后随即用干冰运送到实验室，置于-80℃冰箱冻藏待用。各地虾样采集地点如表1所示。

表1 采样地区及邻近海域Tab.1 Sampling area and adjacent marine area

1.1.2 主要化学试剂质量分数3%氯化钠碱性蛋白胨水、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（thiosulfate cirate bile salts sucrose，TCBS）琼脂、质量分数3%氯化钠三糖铁琼脂、水解酪蛋白琼脂（mueller-hinton agar，MHA）、副溶血性弧菌成套生化鉴定管、沃格斯-普洛斯（voges-proskauer，V-P）试剂（青岛海博生物技术有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物、药敏纸片（英国OXOID公司）；氯化钠、琼脂粉（德国BioFroxx公司）；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）预混液（美国普洛麦格生物公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 副溶血弧菌的分离纯化参照国家标准［7］，在无菌操作下取3～5只虾，虾肉、虾肠道分别与质量分数3%氯化钠的碱性蛋白胨水溶液混合，配制成质量（g）与体积（mL）比为1∶10的样品匀液，36℃培养8～18 h。将培养后的增菌液划线接种于TCBS平板上，36℃培养18～24 h。将疑似菌落在平板上纯化培养，纯化的菌株置于-80℃保存备用。

1.2.2 生理生化鉴定参照国家标准［7］，将纯培养的菌株进行革兰染色，并采用副溶血弧菌成套生化鉴定管进行氧化酶试验、嗜盐性试验、动力试验、甘露醇试验、赖氨酸脱羧酶试验、V-P试验和β-半乳糖苷酶（ONPG）试验。

1.2.3 16S rRNA基因鉴定利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行DNA提取。取1 mL过夜培养菌液8 000 r/min离心1 min后收集菌体。加入400 μL裂解液后于65℃水浴1 h使细胞完全裂解。加入20 μL核糖核酸酶A溶液后放置5min。加入200 μL磷酸缓冲液，颠倒混匀后-20℃静置5 min。10 000 r/min离心5 min，取上清液，加入等体积的异丙醇充分混匀，放置3 min。10 000 r/min离心5 min后弃上清。加入1 mL体积分数75%乙醇，漂洗充分后10 000 r/min离心2 min，弃上清。重复洗涤，将残留的乙醇完全挥发。用100 μL氨基丁三醇-乙二胺四乙酸缓冲液溶解沉淀。得到DNA溶液。

选择16S rRNA基因扩增的27F/1492R引物对进行PCR扩增。引物对序列为：27F：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。

整个反应的总体系为50 μL：PCR预混液25 μL，10 μmol/L 27F 2 μL，10 μmol/L 1429R 2 μL，细菌基因组DNA模板1 μL，无菌双蒸水20 μL。PCR扩增程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸30 s，总循环数为35；72℃延伸5 min。

扩增的PCR产物送至武汉擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对。

1.2.4 副溶血弧菌抗生素药物敏感性测定分离菌株对抗生素的敏感性测定采用纸片扩散法，将分离菌株菌液稀释至108CFU/mL，均匀涂布于MHA平板，贴上不同的抗生素纸片，于36℃培养24 h，测量抑菌圈的直径。评价标准参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所给出副溶血弧菌相关抗生素敏感性标准［8］。药敏纸片选用4大类11种抗生素，包括β-内酰胺类抗生素7种：氨苄西林（ampicillin，AMP）、哌拉西林（piperacillin，PRL）、头 孢 噻 肟（cefotaxime，CTX）、头 孢 西 丁（cefoxitin，FOX）、头孢吡肟（cefepime，FEP）、亚胺培南（imipenem，IPM）、头孢他啶（ceftazidime，CAZ）；四环素类抗生素2种：四环素（tetracycline，TE）、土霉素（oxytetracycline，OTC）；喹诺酮类抗生素：环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）；氨基糖苷类抗生素：庆大霉素（gentamicin，CN）。质控菌株为副溶血弧菌ATCC 17802，每次试验均重复三次。

2 结果与讨论

2.1 副溶血弧菌分离结果

从三个采样区养殖的南美白对虾分离出7株疑似菌株。宁波的分离菌株命名为NB-C1-1、NBC1-2；青岛分离株为QD-C1、QD-C2、QD-C3；东营分离株为DY-C1-1、DY-R2-1。

疑似菌株在TCBS平板上是圆形、半透明且表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有黏性，直径2-3 mm，部分分离菌株菌落形态如图1。

图1 分离菌株的典型菌落形态：（a）宁波分离株NB-C1-1，（b）青岛分离株QD-C3，（c）东营分离株DY-C1-1Fig.1 Typical colony morphologies of isolated strains：（a）NB-C1-1 isolated from Ningbo，（b）QD-C3 isolated from Qingdao，（c）DY-C1-1 isolated fromDongying

2.2 菌株生理生化鉴定结果

7株疑似菌株均为革兰阴性菌，呈卵圆状，无芽孢。由副溶血弧菌成套生化鉴定管测定分离出的7株菌的生理生化特征列于表2中，可以发现这7株菌均为氧化酶、赖氨酸脱羧酶和甘露醇阳性，耐盐，有动力，V-P和ONPG阴性。这些特征与国标［7］中副溶血弧菌主要特征完全符合。

表2 7株菌株生理生化鉴定结果Tab.2 Physiological and biochemical identification results of 7 strains

2.3 菌株16S rRNA基因鉴定结果

16S rRNA基因测序结果显示：菌株NB-C1-1序列长度为1 395 bp，菌株NB-C1-2序列长度为1 386 bp，菌株QD-C1序列长度为1 397 bp，菌株QD-C2序列长度为1 396 bp，菌株QD-C3序列长度为1 381 bp，菌株DY-C1-1序列长度为1 370 bp，菌株DY-R2-1序列长度为1 378 bp。

将测序结果在NCBI网站上利用基于局部序列比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对分析，并应用分子进化遗传分析（molecular evolutionary genetics analysis version 11，MEGA 11）软件对7株副溶血弧菌的16S rRNA基因进行序列分析，将菌株序列与NCBI中已录入的副溶血弧菌16S rRNA基因核苷酸序列进行多重比对，构建邻接法（neighborjoining，N-J）系统发育树（图2）。结果显示，7株细菌均为副溶血弧菌，除菌株NB-C1-1与Vibrios parahaemolyticus的相似性为99.86%，其余菌株的与Vibrios parahaemolyticus的相似性均为100%。同时可以看出同一地区分离出的不同株的副溶血弧菌之间差异性较小。

图2 分离菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains

生理生化鉴定和16S rRNA基因测序结果，确定分离7株菌均为副溶血弧菌。（GenBank登录号分 别 为：ON125507、ON125508、ON125509、ON125510、ON125511、ON125512和ON125513）

2.4 药敏试验

7株副溶血弧菌的抗生素药敏试验，结果如表3所示，显示从这三个地区所分离的菌株耐药性不完全一致，同一地区分离的菌株耐药性相对一致。东营养殖的南美白对虾分离的副溶血弧菌的耐药谱较广，对AMP、PRL、TE和OTC这两大类4种抗生素表现出耐药性；宁波和青岛养殖的南美白对虾分离的副溶血弧菌则仅对AMP和PRL这两种抗生素耐药。

表3 分离副溶血弧菌药敏实验结果Tab.3 Drug susceptibility test results of isolated Vibrio parahaemolyticus

将分离的7株菌株对抗生素的耐药性进行统计，结果如表4所示。分离出的所有菌株都对AMP和PRL耐药，对TE和OTC耐药的占28.57%，对其他6种抗生素CTX、FOX、FEP、IPM、CAZ和CIP均为敏感。

表4 副溶血弧菌耐药性统计Tab.4 Statistics on drug resistance of Vibrio parahaemolyticus

2.5 不同地区副溶血弧菌耐药性分析

本研究结果表明不同地区分离的副溶血弧菌对抗生素的耐药性不同。在三个采样区域中，东营位于渤海沿岸，养殖的南美白对虾分离的菌株的耐药谱最广，对四环素类（OTC和TE）和β-内酰胺类（AMP和PRL）的抗生素具有耐药性。Zhang等［9］对渤海湾近岸海域水体中抗生素进行检测，发现OTC的残留量最高，平均达到69.8 ng/L，四环素类抗生素的耐药风险和生态风险最高。对渤海沉积物中抗生素残留量调查［10］发现，四环素类抗生素的平均浓度和最高浓度普遍高于其他抗生素。渤海是我国的内海，抗生素污染的情况相较其他海域严重一些［11］，其抗生素残留与我们检测的该区域养殖的南美白对虾中副溶血弧菌的耐药情况相一致，可推测该区域细菌耐药性的产生与抗生素残留有关。

青岛和宁波养殖南美白对虾中副溶血弧菌仅对2种β-内酰胺类（AMP和PRL）抗生素耐药。青岛位于黄海沿岸，Han等［12］对黄海海域的海水养殖场水体中抗生素残留量进行检测，发现CIP和恩诺沙星是浓度最高的抗生素，甲氧苄啶是最普遍存在的抗生素。宁波位于东海沿岸，Li等［13］对东海沿岸海水和沉积物进行抗生素的检测，发现含量最高的分别是克林霉素和红霉素，四环素类的抗生素残留量是检测出的五大类中最低的。以上报道中四环素类的抗生素残留较低，与本研究结果中这两地的副溶血弧菌没有对四环素类的抗生素产生耐药性相一致。

β-内酰胺类和四环素类是养殖常用的抗生素种类，β-内酰胺类抗生素主要通过抑制与细菌细胞壁合成有关的酶——青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），阻碍细胞生长，而四环素类抗生素的主要通过与核糖体30S亚基结合，阻碍细菌蛋白质合成［14-15］。细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性主要是通过三种机制：（1）靶标PBPs的改变；（2）修饰或者下调外膜孔蛋白减少对抗生素的摄取或者生产过量的外排泵；（3）产生β-内酰胺酶将抗生素分解为非活性化合物［14，16］。细菌对四环素类抗生素产生耐药性主要是通过两种机制：（1）核糖体保护机制，通过核糖体突变，改变靶标核糖体亚基；（2）由外排介导的耐药机制，以质子交换作为能量来促进四环素外排［15，17］。

由上述分析可知南美白对虾养殖区域抗生素含量和所分离株的耐药性有一定的关联，但是由于细菌耐药性的成因比较复杂，更多原因还需进一步探究。

3 结论

本研究从东营、青岛和宁波养殖的南美白对虾中分离并鉴定了副溶血弧菌，抗生素敏感性检测表明东营分离株对四大类11种抗生素中的两类4种抗生素具有耐药性，青岛和宁波的分离菌株对一类2种抗生素具有耐药性。分离的副溶血弧菌都对AMP和PRL耐药。本研究结果发现食源性分离的副溶血弧菌耐药情况比较严重，对人体健康安全存在一定的风险性，部分分离株的耐药性可能与该地区抗生素滥用有关联，所以今后的水产生产中要注意抗生素的规范化使用。