肿瘤浸润免疫细胞与乳腺癌新辅助化疗敏感性及预后关系的研究进展

林佳雯，卫姣飞综述，李淑琴审校

0 引 言

世界卫生国际癌症机构表明2020年乳腺癌的新发病例数已达全球第一，且其发病年龄年轻化[1]。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NACT)由于其变不可手术为可手术、不可保乳为保乳、观察药敏性等优点被广泛应用。pCR通常表示预后的改善，被视为长期生存的替代终点。但是，NACT后并非全部乳腺癌患者均可得到病理完全缓解(pathologic complete response，pCR)。有研究收集1999名接受NACT的乳腺癌患者的临床资料，发现仅有21.8%患者可获得pCR[2]。一些患者肿瘤消退不显著，甚至短期内进展，错过了最佳的手术时机。因此，需要将这部分对化疗不敏感的患者挑选出来制定其他治疗方案。

Ki-67水平、组织学分级和乳腺癌的分子亚型等已被报道可预测患者对化疗的反应和预后[3]。但是目前并未有系统的方法来准确的预测。最近一些研究表明，化疗敏感性和预后在很大程度上取决于癌细胞与肿瘤微环境中不同组分，尤其是与肿瘤浸润免疫细胞(tumor-infiltrating immune cells，TICs)之间的相互作用[4]。因此，研究乳腺癌中TICs与NACT的相关性，找出化疗敏感性的预测因子，并针对这种因子来开发逆转化疗耐药的药物，对指导化疗用药、提高化疗的效率有重要意义。本文就肿瘤中部分免疫细胞在新辅助化疗环境中的作用作一综述。

1 肿瘤免疫微环境与肿瘤浸润免疫细胞

免疫系统被认为在癌症的整个进展发挥着重要作用。免疫监视学说认为，免疫系统能对体内进行巡查，当发现突变的体细胞时可予以清除[5]。当细胞发生癌变，免疫系统能够对其识别、消灭，阻止肿瘤的发生。但是后续的研究表示，肿瘤细胞可通过各种机制逃脱这一监视，形成相应免疫抑制微环境。当发展至免疫逃逸时，肿瘤快速增殖，与周围环境相互斗争，导致临床肿瘤出现[6]。这表明免疫系统起到了保护宿主和刺激肿瘤生长的双重作用。

1.1肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)循环血中的巨噬细胞被癌细胞释放的炎症信号吸引，在肿瘤中转化为TAMs，是肿瘤基质的核心，决定肿瘤内免疫状态。TAMs分为M1以及M2型。M1型TAMs由脂多糖和促炎细胞因子如干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)激活，可诱导辅助性T细胞(helper T cell，Th)1型免疫反应，具有促炎和抗瘤免疫活性的能力，能清除病原体，杀死肿瘤细胞，对抗肿瘤。M2型TAMs由抗炎细胞因子白介素-4和白介素-13等诱导，呈递抗原能力低，诱导Th2型免疫反应，促进肿瘤生长[7-8]。TAMs在早期可识别癌细胞并将其抗原呈递给免疫系统的效应器，而在晚期通过刺激肿瘤生长、血管生成、转移和免疫抑制促进肿瘤的浸润和转移[9]。并且，TAMs在肿瘤进展的所有阶段都很丰富，可通过产生生长因子和消化细胞外基质的蛋白水解酶，刺激癌细胞增殖和传播[10]。

1.2肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)在免疫反应中，淋巴细胞负责识别非我，并通过细胞毒性作用(细胞免疫)消除非我，并产生和分泌针对外来蛋白质的抗体(体液免疫)。这是一种通过自身免疫对抗自我毁灭的生理防御机制。因此，TILs是最能反映癌症免疫反应强度和特征的细胞[11]。在乳腺癌细胞成分中，大量TILs亚型参与了癌症免疫编辑，在与癌细胞的相互作用中起着独特的作用。在乳腺癌中T细胞含量最多，B细胞和自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)等较少。CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)主要通过释放包括穿孔素和颗粒酶在内的蛋白水解酶和溶细胞酶，诱导肿瘤细胞死亡发挥抗癌作用。CTL的激活和成熟是通过Th1细胞产生的 IFN-γ和树突细胞处理的特定肿瘤相关抗原进行调节，被认为是针对癌症的免疫监视的主要介质[12]。此外，NK细胞、CD4+Th1细胞已被证明可防止肿瘤生长，而CD4+Th2和CD4+FOXP3+调节性T细胞被认为促进肿瘤生长[13-15]。

1.3肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TANs)中性粒细胞通过分泌细胞因子和趋化因子来调节炎症反应，被认为是抵御不同类型微生物的首道防线。中性粒细胞可沿着肿瘤细胞和免疫细胞等产生的趋化因子进入肿瘤组织中，在微环境中转化为TANs。其中，白介素-8被认为是肿瘤微环境中最重要的中性粒细胞趋化因子。与TAMs相似，TANs被极化为N1(抗肿瘤)或N2(促肿瘤)型[16]。TANs已经被报道为影响肿瘤细胞增殖、组织重塑、血管生成、上皮遗传不稳定性和淋巴细胞介导的免疫[17]。

TANs的表型取决于肿瘤微环境特征和疾病进展阶段。在转化生长因子-β的存在下，TANs通常被极化为促肿瘤的N2型，而在干扰素-β丰富的环境中，TANs转变为抗瘤的N1型[18]。此外，通过研究小鼠模型，研究者发现，TANs在肿瘤早期更具细胞毒性，能产生高水平的肿瘤坏死因子-α，NO和H2O2，并且随着肿瘤的扩散和发展而获得促肿瘤表型[19]。许多研究描述，在乳腺癌的最后阶段，癌细胞过度表达白介素-8，并通过中性粒细胞分泌的酶增强癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[20]。

1.4肿瘤浸润树突状细胞(tumor-infiltrating dendritic cells，TIDCs)树突状细胞(dendritic cells，DCs)作为免疫系统中最有效的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，启动和引导适应性免疫反应，其功能缺陷可能导致癌症中无效的抗肿瘤免疫反应。在癌症中，DCs被称为TIDCs。其呈递抗原的能力可能取决于成熟度、位置，也可能取决于乳腺癌周围和乳腺癌内的区域差异[21]。

2 TICs与乳腺癌新辅助化疗

2.1TAMsTAMs在多数研究中都显示与预后不良相关，并且预后只与TAMs的高浸润有关，与组织学位置无关[22]。只有在少部分研究中，肿瘤间质和癌巢内的TAMs与不良预后的关联程度不同[23]。有研究发现人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)过度表达的乳腺癌患者接受新辅助紫杉烷和蒽环类药物治疗后，CD68+TAMs(巨噬细胞表型)与乳腺癌患者的无病生存期(disease free survival，DFS)和总生存率(overall survival，OS)呈负相关[24]。陈馨等[25]的研究也证明了NACT前后CD68+TAMs均与DFS和OS呈负相关，均为DFS的独立危险因素。

此外，Arole等[26]的研究指出，M2型TAMs在预测三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)患者的NACT疗效中具有重要作用。研究发现，非pCR 患者的 CD163+TAMs(M2型巨噬细胞表型)水平显著高于获得pCR患者(癌巢：35.9%vs22.8%，P=0.003；间质：39.2%vs24.8%，P=0.003)。另一项回顾性研究也发现，低浸润CD163 +TAMs的患者比高浸润的患者有着更高的 pCR 率(42.9%vs20.0%，P=0.025)，而化疗前肿瘤内高浸润CD163+TAMs的TNBC患者的无复发生存率(relapse-free survival，RFS)和OS较差(P均<0.05)[27]。而陈馨等[25]研究各亚型乳腺癌与pCR的相关性发现，激素受体(hormone rcceptor，HR)阳性乳腺癌的pCR率显著低于其他分型，或许是由于这型乳腺癌患者对化疗的敏感性较差。总之，这些数据均显示TAMs有望成为预测NACT化疗反应和预后的指标。

同时，不止一项研究表示，CD163+TAM 的高浸润患者与侵袭性行为密切相关，在NACT后更易发生远处转移。这或许说明了TAMs 在乳腺癌患者的化疗耐药中起着关键作用。Hughes等[28]建立肺癌小鼠模型和乳腺癌转移小鼠模型，发现环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素对小鼠的治疗导致M2型TAMs显著增加。并且，化疗后M2型TAMs主要聚集在肿瘤血管丰富的趋化因子CXCL12区域，促进肿瘤的血运重建和复发。

化疗可诱导M2型TAMs，并通过分泌生长因子、细胞因子和抑制肿瘤细胞死亡信号通路等机制来介导化疗耐药，从而保护肿瘤细胞免受化疗的细胞毒作用[29]。Kim等[30]建立同系鼠乳腺癌模型，用紫杉醇治疗荷瘤小鼠后发现，TAMs中M1标记CD86的表达显著下调。并且TAMs吞噬乳腺癌细胞碎片，上调血红素加氧酶-1，促使TAMs从M1型向M2型TAMs转变，降低化疗效果。并且，TAMs分泌的高水平白介素-10可以激活信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号，上调BCL-2基因，增加人乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。白介素-10抗体能减弱 STAT3 活化、降低BCL-2 mRNA 表达，从而提高乳腺癌细胞敏感性[31]。此外，有研究表示，化疗后募集的TAMs可减弱化疗反应，并提供表达组织蛋白酶防止共培养中紫杉醇诱导的肿瘤细胞死亡[32]。这种作用可被组织蛋白酶抑制完全逆转，并部分由组织蛋白酶B和S介导。这些证据都表明，紫杉醇等化疗药物能够影响TAMs的功能，对化疗疗效产生影响，介导化疗耐药。靶向TAMs抑制肿瘤细胞与TAMs的相互作用，可能是逆转化疗耐药、抑制肿瘤进展的一种有效途径。

2.2TILs过去，乳腺癌被认为不具有免疫活性。然而多项研究证据表明，乳腺癌中TILs和化疗反应有很强的相关性， 并且在改善所有亚型乳腺癌的临床结果方面发挥着重要作用。TILs可分为间质与瘤内TILs，分别浸润肿瘤间质和肿瘤上皮细胞。并且临床试验表明，间质和瘤内TILs每升高10%复发风险分别降低15%和17% (调整后P=0.025和P=0.1)[33]。这表示了TILs的增高对乳腺癌患者的效益巨大。在乳腺癌的所有分型中，TNBC是最有可能出现超过50%TILs的亚型，即淋巴细胞为主的乳腺癌(lymphocyte-predominant breast cancer，LPBC)。间质TILs和LPBC被一些研究证明是pCR的独立预测因子[34]。

Denkert等[35]通过研究1058例NACT前乳腺癌活检组织首次证明，TILs可预测乳腺癌患者的pCR率。在接受以蒽环类或紫杉烷为基础的NACT后， TILs高浸润组患者(>10%)的pCR率远高于低浸润组(40%～42%vs3%～7%)。随后，为研究TILs在各亚型乳腺癌中的价值，Denkert等[36]又研究了3771名乳腺癌患者NACT前活检组织间质内TILs，发现TILs高浸润组的所有乳腺癌亚型的pCR率均较高。并且TILs浓度升高与TNBC患者的OS和DFS正相关(P=0.032，P=0.011)， 与HER2+乳腺癌的DFS正相关(P=0.017)，却与luminal HER2-肿瘤患者中的OS负相关(P=0.011)。在所有乳腺癌亚型中，TILs与NACT患者pCR均有很强的正相关，但是TILs浓度对DFS和OS的影响在乳腺癌不同亚型之间存在差异。该文献作者推测其可能是由于TNBC和Luminal HER2-乳腺癌在细胞组成和免疫细胞的预后上存在差异。在TNBC中，存在着众多免疫细胞亚型(包括B细胞、T细胞和巨噬细胞等)，与提高存活率有关。而在Luminal HER2-乳腺癌中，唯一与改善预后相关的细胞类型是B细胞和髓系树突状细胞。

另外， TNBC患者NACT前的CD4+TILs、CD8+TILs、FOXP3+TILs和CD8/FOXP3+TILs比值与 pCR率呈正相关， CD8+ TILs 是 pCR 的独立预测因素。并且，CD8+/FOXP3+TILs可能是监测免疫功能的更敏感指标，可用来识别乳腺癌，特别是TNBC中对NACT反应良好的患者[37-38]。并且有研究表示，在HER2+乳腺癌中，肿瘤浸润性NK细胞对抗HER2抗体新辅助治疗和标准新辅助化疗的pCR结果有很大的预测价值[39]。即使NACT方案、乳腺癌分子表型都不同， TILs和pCR之间均存在着显著的相关性。这表明了TILs有望成为乳腺癌患者NACT敏感性的标志物。并且从目前的研究来看，淋巴细胞浸润的肿瘤表现为对化疗更敏感，或许可通过靶向TILs来开发化疗增敏的策略。虽然目前临床并不推荐TILs指导系统治疗，但是已经有大量的研究正在被开展来验证其与乳腺癌的相关性，TILs在临床上应用指日可待[40]。

2.3TANs因为可反映机体的免疫功能，外周血中性粒细胞和淋巴细胞之比(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)可作为多种癌症患者预后的独立因素。但是在乳腺癌患者中，NACT前NLR与疗效和预后的关系结论不一[41]。一项对39项研究(包括17 079名早期和晚期乳腺癌患者)的Meta分析表明，NLR的增高和乳腺癌患者不良的OS和高复发风险相关。亚组分析表示，在TNBC患者中，NLR和OS之间的关联程度大于HER2阳性患者[42]。且另一项分析也表示NLR是预测接受 NACT 的乳腺癌患者 pCR 和生存率的合适生物标志物[43]。但是，有部分研究表示，NLR不是新辅助化疗患者预后的预测因子，这可能与NLR易受多种因素干扰或是样本量小有关。已有证据表明，癌巢内 TANs的高浸润与癌症患者的不良预后相关，而癌旁和间质内TANs与临床结局无统计学意义[44]。并且，Geng等[45]的研究表示NACT后较高的TANs被证实与乳腺癌患者较差的化疗疗效和较短的DFS有关，并首次证明NACT前后TANs的动态变化是比NACT后TANs更准确地预测指标。然而，也有研究表明，浸润乳腺癌组织的CD66b+TANs在肿瘤微环境中数量很少，且与新辅助化疗pCR无关[46]。总之目前的相关研究还有很多不足，需要进一步的补充证实。另外有研究证明，乳腺癌细胞和TANs的相互作用也在化疗耐药中起着重要作用。在人类乳腺癌数据集中，耐药患者的肿瘤中，中性粒细胞相关标志基因的表达高于对化疗敏感患者的肿瘤[47]。癌细胞可上调肿瘤细胞中炎性趋化因子，如CXC受体2(CXC receptor 2，CXCR2)及其配体[48]。Sharma等[49]研究发现，化疗后CXCR2及其配体在乳腺癌细胞系中表达上调，靶向CXCR2可增强化疗的疗效。

2.4TIDCsTIDCs 在乳腺癌NACT中的研究较少。Kaewkangsadan等[46]对 33 名接受NACT的大型和局部晚期乳腺癌患者进行分析发现，在NACT后，原发性乳腺肿瘤和转移性腋窝淋巴结中的CD1a+TIDCs水平显著降低，与pCR无明显关联。

3 结 语

现阶段已有不少对TICs的研究，但其与化疗的相关性研究尚不完善。通过研究TICs和乳腺癌NACT敏感性的相关性，及早识别需要替代治疗的患者，对于乳腺癌患者的个体化治疗大有帮助。并且，将免疫成分作为治疗靶点改变肿瘤微环境，调节肿瘤细胞和免疫微环境之间的相互作用，可逆转化疗耐药、增强化疗疗效、抑制肿瘤生长和降低转移风险。但是目前大多数相关的研究都是回顾性的，并且使用的NACT方案存在差异，样本量也不足，所以还需要进行大量的前瞻性研究来明确其相关性，构建出完善的预测体系。同时，联合使用这些预测指标或许比单独某项指标更具价值。