肖梦瑶,辛小娟
重庆医科大学附属第一医院感染科,重庆 400016
EBV 相关淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)不是特指一种疾病,而是一类疾病的总称,近年相关疾病谱已经从传染性单核细胞增多症(IM)扩展到淋巴瘤、白血病等恶性肿瘤[1]。根据其恶性程度与感染后增殖细胞类型分为反应性增生、B 细胞相关LPD、T/NK 细胞相关LPD。除IM 表现为自限性,严重EBV-LPD 临床进展迅速,患者常死于LPD 的进展、免疫下降继发的机会性感染、多器官功能衰竭,现在的治疗方案多采取多药联合化疗,但效果十分有限,迫切地需要研究新的治疗手段[2]。多项研究报道高EBV 定量对于EBV-LPD 的预后有着不良影响,降低病毒定量可提高EBV-LPD 患者生存率,但到目前还没有研究出被批准用于人类的抗EBV 药物。EBV是一种以人类为惟一宿主的疱疹病毒,自1964 年,EBV 被Epstein 和Barr 从伯基特淋巴瘤中分离出来,而后的50 年里其致癌性得到了充分的认识,但到目前为止其在EBV-LPD 疾病中所扮演的角色仍不完全清楚。研究[1]发现,EBV 通过下调抗原的表达逃避免疫监视,从而在宿主体内建立难以清除的终身潜伏感染,其潜伏期病毒蛋白可扰乱免疫功能,激活多条肿瘤信号通路诱发宿主细胞异常增殖转化。明确EBV-LPD 的原因及机制,或可为预防和治疗EBV-LPD 提供新的治疗方向和靶点。 现将EBV-LPD 发生的原因及发病机制的研究进展综述如下。
EBV 在人体内有裂解感染和潜伏感染两种状态。裂解感染状态下,病毒可进行完整的基因复制和病毒蛋白的表达,产生大量子代病毒,诱发免疫反应使受染细胞裂解。潜伏感染时,病毒不能复制产生具有传染性的子代病毒颗粒,但可逃避免疫清除,从而在宿主淋巴组织内建立起终身潜伏感染。当机体免疫功能下降时,潜伏期EBV 可重新激活进入裂解期。特殊的双相生命周期使得病毒无法被彻底清除从而诱发LPD。
1.1 EBV 裂解感染 EBV 主要通过唾液传播,进入人体后先感染口咽黏膜上皮细胞,此期感染在大多数个体中是无症状的,这种在口咽黏膜上皮的溶解复制是为了有效地将病毒释放到唾液中,从而将EBV 传递给新的宿主实现体外传播[3]。上皮细胞裂解后,释放入血的EBV 通过gp350/220 抗原附着于B 细胞表面CD21 受体上,在病毒糖蛋白gH-gL-gp42与B细胞表面人类白细胞抗原(HLA)-II类受体作用下通过胞吞或包膜融合作用进入胞内[4]。入胞后病毒诱导产生两种蛋白质(Rta 和Zta)作为转录激活剂,促进病毒DNA 转录、翻译形成新的结构蛋白,与EBV 基因一起装配成具有传染性的子代病毒。细胞内病毒大量扩增,诱导受染B 细胞形成淋巴细胞识别膜抗原,刺激NK 细胞及EBV 特异性细胞毒性T 细胞(CTL)扩增,攻击受染细胞使之裂解,细胞内病毒释放入血后再感染新的细胞从而实现体内传播[5]。
1.2 EBV 潜伏感染 免疫活性人群中,原发感染的裂解期大部分受染细胞及病毒可被顺利清除,仅部分EBV 在宿主淋巴组织中建立起终身潜伏感染。潜伏期被认为与肿瘤性疾病的关系更密切,这种裂解期向潜伏期的转变过程尚未完全明确,目前比较认可的是根据B 细胞建立的潜伏期模型。
EBV 感染幼稚B 细胞后先表现为潜伏Ⅲ型,此期病毒表达 6 种核蛋白(EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBN3B、EBNA3C、EBNALP),3 种潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B),2 种非编码小 RNA(EBER1、EBER2)和 BamHI-A 片段右向转录产物(BARTs)。此期受染细胞免疫原性强,易被CTL免疫反应消除,故这种病毒基因表达模式更常见于免疫系统受到严重抑制的患者[1]。感染的B 细胞进入生发中心,EBV 为逃避免疫下调抗原表达,表现为潜伏Ⅱ型,此期EBV 蛋白表达仅限于EBNA1、LMP1、LMP2 和 EBER。在病毒蛋白的作用下,这些细胞中的一部分分化为记忆B 细胞,线性病毒DNA 环化,作为细胞核附加体游离在胞质中,此时多表现为潜伏0/Ⅰ型(0 型只能检测到EBER,1 型还表达EBNA1),易逃避免疫系统的监控,静息记忆B 细胞释放到循环中,成为病毒长期潜伏储存库[6]。此期EBV 虽不能产生感染性子代病毒颗粒,但可在S 期随着细胞DNA 复制扩增从而传递至分裂分化的子代细胞,从而避免因为机体细胞的正常凋亡机制导致体内的病毒随之死亡。
1.3 EBV 潜伏期重激活 裂解期的EBV 基因表达有助于病毒感染新的细胞和宿主,而潜伏期的建立对于病毒逃避免疫监视从而在宿主体内的终生存活至关重要。正常免疫环境下,潜伏期EBV 和免疫系统维持在平衡状态,当机体免疫功能下降时潜伏期EBV 可重激活进入裂解期,再次引起急性感染症状。潜伏期时BZLF1 编码的Zta 与BRFL1 编码的Rta 受到高度抑制,潜伏期的重新激活取决于相关区域的启动[7]。环状EBV 通过修饰病毒基因组中特定DNA 序列的去甲基化,使这两种基因过度表达,调节潜伏状态的EBV 进入裂解周期[8]。免疫功能恢复后机体与病毒可再次达到平衡状态,但部分患者会出现难以控制的反复重激活,引起持续的病毒血症,引起这种现象的原因尚不明确,考虑与患者自身存在的原发免疫缺陷有关。EBV 在潜伏状态下的复制不依赖于DNA 聚合酶,而是通过核抗原调控DNA 的复制,使其对于现在常用的无环核苷类似物(如更昔洛韦)及焦磷酸盐类似物(如磷钾酸钠)的治疗无效。针对EBV 可重激活这一特点,当前有学者提出的诱导EBV 进入裂解感染,从而使抗病毒治疗有效将成为一个新的思路。PIERLUIGI 等[9]使用组蛋白乙酰化酶抑制剂联合缬更昔洛韦治疗EBV 阳性的复发难治淋巴瘤取得了一定疗效,且无严重不良反应发生。
EBV 感染人体后诱发LPD 的机制可分为两个方面。一方面是病毒引起机体免疫紊乱,主要表现为NK 细胞和CTL 功能不全和淋巴细胞活性过高。EBV 通过病毒蛋白干扰抗原递呈细胞,活化的T 淋巴细胞刺激巨噬细胞分泌超量的细胞因子,导致全身炎症反应及淋巴细胞持续的异常活化。另一方面病毒通过潜伏期蛋白激活多条肿瘤信号通路,抑制宿主细胞凋亡,诱导淋巴细胞异常增殖转化,从而导致LPD的发生。
2.1 EBV 引发机体免疫紊乱 EBV 感染人体后,细胞免疫对清除病毒感染至关重要。NK 细胞在原发感染后4~6 周大量扩增,在病程早期CTL 特异性免疫还未建立时起重要作用。在抗原呈递细胞的作用下CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、迟发型超敏反应T细胞等激活,CTL大量扩增[10]。CTL作为控制病毒扩增及淋巴细胞增殖的主力,与受染细胞接触可形成免疫突触,通过淋巴毒素、穿孔素、颗粒酶等诱导靶细胞裂解,也可通过肿瘤坏死因子途径诱导受染细胞凋亡[5]。CTL 扩增可导致大量炎症因子释放,引起发热、肝脾肿大、淋巴结肿大、咽扁桃体炎等症状,即传染性单核细胞增多症。
2.1.1 EBV 引起NK 细胞和CTL 功能异常 在正常情况下,NK 细胞和CTL 扩增,清除病毒感染细胞的同时去除抗原刺激从而调节炎症反应,原发感染的症状会逐渐消退。但当NK 细胞和CTL 病毒清除功能受损时,靶细胞死亡机制受损,细胞毒性细胞持续受到刺激,引起Th1、Th2细胞因子分泌比例失调,产生大量如 IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α 等 Th1 类细胞因子,激活巨噬细胞,CTL与抗原提呈细胞之间负反馈机制失调,级联放大引起全身细胞因子风暴,严重时出现噬血细胞综合征[11]。在病毒的诱导下,增殖转化的受染靶细胞也失去有效的免疫监控,最终导致癌变。EBV 感染后通过何种途径影响NK 细胞和 CTL 的功能尚在研究中,有研究[12-13]报道,CAEBV、EBV-HLH、EBV 相关淋巴瘤患者的 CTL、NK 细胞数量减少且有功能障碍。
2.1.2 EBV 感染 T/NK 细胞 EBV 是嗜淋巴细胞的病毒,它不仅感染B 细胞,也会感染T/NK 细胞。部分学者认为,严重的EBV-LPD 可能和EBV 感染T、NK 细胞有关[14]。但当前没有研究证明,EBV 是引起患者T/NK 细胞等数量下降的直接原因,且目前EBV 感染T/NK 细胞的机制尚不完全明了,T/NK细胞上CD21 受体和人白细胞抗原(HLA)都检测不到。一种假设是带有病毒株的T/NK 细胞是由淋巴祖细胞和原始T 淋巴细胞分化而来的,后两者表达CD21受体从而可感染EBV。有研究[15]对CAEBV 患者的受染细胞类型进行检测,发现存在T/NK 细胞的双重感染。另一种假设是EBV 通过受染上皮细胞或B 细胞传播给T/NK 细胞,T/NK 细胞在接触受染细胞时通过突触转移获得CD21 分子从而感染EBV[16]。感染 EBV 的 T/NK 细胞通常表达细胞毒性分子,在机体免疫反应中起清除病原体的作用,支持它们是由EBV 感染的B 细胞激活的毒性T/NK细胞。
2.1.3 EBV 病毒蛋白抑制NK 细胞和CTL 功能有研究[17]报道,EBNA-1 中有 1 个甘氨酸—丙氨酸重复区域,此区域能影响泛素化底物和蛋白酶体的相互作用,且该区域可以抑制缺陷核糖体产物,使得人主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ合成受限,从而干扰EBNA-1 抗原加工和呈递,影响CTL对EBNA-1 抗原的免疫应答。LMP1 被发现有两个与p15E(一种含有免疫抑制肽链序列的膜蛋白)高度同源的多肽,可强烈抑制CTL 和NK 细胞的活性,减少干扰素的合成,从而影响T 细胞识别EBV 抗原[18]。EBV 编码的小RNA(EBER)在各类细胞中丰富表达,主要用于病毒的临床检测。有研究报道,EBERs 可诱导IL-10 的产生,从而抑制CTL 功能。HLA-A 和HLA-B 通过与活化型杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合使NK细胞活化,而HLA-C则与抑制型KIR 结合抑制NK 细胞杀伤效应,EBV 的BCRF1编码的蛋白可下调HLA-A和HLA-B的表达,但不能下调HLA-C 的表达,从而抑制NK 细胞的活化。EBV 早期蛋白BFRF1 被证实能通过抑制IRF3的激活抑制IFN-β 的活性,在破坏宿主固有免疫中发挥关键作用[19]。
进一步研究EBV 感染T/NK 细胞的方式及病毒影响免疫细胞功能的方式,有助于重建机体自身免疫。当前使用CTL 治疗EBV-LPD 的作用及安全性已经得到了肯定[20],但制备耗时较长,还需探究如何精简其制备工艺,如果能证明输注供体来源的CTL的有效性及安全性,将大大提前治疗时间[21]。
2.2 EBV 潜伏期蛋白诱导淋巴细胞增殖转化 EBV 为逃避免疫监视通过减少编码抗原的免疫原性进入潜伏期,然而病毒想要永久存在宿主体内,除了必须避免被机体免疫系统清除,同时需要避免因为正常的宿主细胞凋亡更替机制而随之死亡。除了适时进入裂解期产生有传染性的子代病毒颗粒,潜伏期病毒蛋白可驱动多条肿瘤相关信号通路,从而诱导细胞增殖、抑制细胞的凋亡、诱导细胞永生化和转化。研究EBV 激活的肿瘤信号途径可为新的治疗方案提供候选靶点。
2.2.1 EBV 潜伏期核蛋白诱导宿主淋巴细胞增殖转化 EBV 编码的核抗原EBNA-1 在病毒基因组的维持和复制中起着关键作用,它将潜伏期EBV DNA 附加体束缚在宿主细胞染色质上,以确保病毒DNA 在宿主细胞有丝分裂期间复制。EBNA1 也是EBV 诱导宿主细胞增殖和永生化的重要因素,它可以上调凋亡抑制蛋白Survivin 的表达,促 BCL-6、CD10 的增加,使 B 细胞异常转录,导致伯基特淋巴瘤的发生[22]。正常细胞会通过DNA损伤应答来维持基因组完整性和正确性,以减少恶性的表位突变,是极其关键的免疫监控途径。EBNA1 被证明可通过结合P53 调节因子来稳定P53 从而对抗正常的 DNA 损伤应答机制[23]。EBNA2 可诱导 LMP1 和 LMP2 表达,也可模仿 Notch 通路,与 RBP-JK/CBF1 结合,激活 MYC 癌基因,上调抗凋亡促生存BCL-2 家族BFL-1/A1 蛋白,下调诱导死亡的凋亡效应蛋白 BIK[24]。EBNA3A 和 3C 常协同作用,通过使转录起始位点TSS 沉默从而下调促凋亡的细胞基因,如BCL2L11(编码促凋亡的仅含BH3 的蛋白BIM)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(P16ink 4a、P15ink 4b)[25]。也有研究[26]证明,EBNA3A 也可单独抑制丝氨酸/苏氨酸激酶39 基因(STK39),导致富含脯氨酸—丙氨酸的激酶(SPAK)的表达丧失,抑制细胞凋亡。EBNA3B是EBV 编码的肿瘤抑制因子,其失活可促进免疫逃避和病毒驱动的淋巴瘤的发生[27]。EBNA-LP 是EBNA2 的转录辅激活因子,对B 细胞的转化必不可少[28]。
2.2.2 EBV 潜伏期膜蛋白诱导宿主淋巴细胞增殖转化 EBV 编码的膜蛋白LMP1 被认为是EBV 最主要的癌蛋白,它可以模拟CD40 诱导的信号通路,通过其两个细胞质信号结构域(CTAR1 和CTAR2)组成性模拟细胞肿瘤坏死因子信号,主要激活NF-κB、JNK、P38 MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT 等信号通路,上调BCL-2 促生存蛋白和其他靶基因的表达[29]。有研究[30]报道,LMP1 可通过激活转录因子AP1 促进程序性死亡受体配体1(PD-L1)的超表达来塑造肿瘤微环境。LMP1 还可上调活化诱导胞苷脱氨酶使MYC 过度表达,诱导肿瘤发生。LMP2A可模仿BCR 受体并提供关键的持续细胞存活信号,主要激活PI3K-AKT-mTOR 和MAPK 信号转导通路,促进 B 细胞存活[1]。LMP2B 可增强 LMP1 的表达,减弱LMP2A 功能,防止EBV 从潜伏到裂解复制的转换。
2.2.3 EBV 非编码小RNA(EBER)诱导淋巴细胞增殖转化 既往认为,EBER 对EBV 诱导的B 淋巴细胞转化不是必需的,但现在有研究[10]发现EBER可通过激活PI3K-AKT 通路和抑制细胞周期抑制剂P21、P27 来促进淋巴细胞的增殖。也有研究[31]报道,EBER 可诱导体外鼻咽癌细胞株产生胰岛素样生长因子1,从而促进癌细胞的生长。
2.2.4 BamHI-A 片段右向转录产物诱导淋巴细胞增殖转化 EBV 编码数十种BART miRNA,在裂解周期中高水平表达,可能是为了保持宿主细胞的存活以确保病毒的有效复制。在EBV 相关的肿瘤患者癌细胞中及在以伯基特淋巴瘤衍生的细胞系为模型进行的体外研究中均检测到EBV miRNA 的过度表达,miRNA 通过与细胞促凋亡蛋白(如仅含BH3的 BIM、PUMA 和 BID 以及 BAK)的结合从而抗凋亡、促淋巴细胞增殖和转化[32]。EBV-miR-BART11和 EBV-miR-BART17-3p 分 别 抑 制 FOXP1 和PBRM1,增强 PD-L1 的转录,从而促进 EBV 相关淋巴瘤的发生[33]。
综上所述,EBV 感染人体淋巴细胞后,其特殊的双相生命周期使得病毒可逃避免疫清除,在宿主淋巴组织内建立起终身潜伏感染,从而诱发EBV-LPD 的发生。EBV 可通过下调抗原表达逃避免疫监视、影响CTL 及NK 细胞免疫功能、抑制细胞凋亡及诱导细胞增殖转化,在LPD 的发生中起重要作用。深入研究EBV 在LPD 发病中的作用及机制,可为有效抗病毒药物的研发提供新的靶点,对改善EBV-LPD患者的预后具有重要意义。