乳牙牙髓干细胞在口腔组织再生修复中的研究进展

李佩 林凌 赵玮

中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院儿童口腔科 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

口腔颌面部的软硬组织损伤严重影响患者口腔颌面部的形态及功能，微创且快速的软硬组织修复再生是临床治疗的目标。创伤愈合和组织修复是一个复杂的生物学过程，临床常用各种皮瓣或组织移植术，或者用生物相容性良好的材料替代缺损组织从而恢复功能，但存在缺点如二次损伤、不美观、周期长、费用高或异物感强等问题，因此口腔颌面部的软硬组织损伤修复再生仍是当前口腔医学面临的一个重要挑战。

近年来，利用组织工程方法修复组织缺损取得了较大进展，它涉及种子细胞、支架材料及生物活性因子等的有机结合，其中种子细胞是组织工程的核心成分。乳牙牙髓干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）是从人类乳牙残留牙髓中分离出来的、具有高度自我更新和增殖分化能力的一类间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），其与中枢神经系统同源，表现出极好的神经分化潜力[1]。从再生医学的角度看，SHED是最有价值的一种MSC，因为随着年龄增长，干细胞数量和质量均会下降，而相对于其他MSC，SHED细胞较接近胚胎特征；此外，SHED容易取得，可长期保存，体外扩增速度快，多系分化能力类似于其他MSC，甚至更胜一筹[2]。

SHED在干细胞治疗领域有广阔的应用前景，本文就近期SHED在口腔组织修复中的研究结果进行回顾总结，阐述其应用优势和可能的作用机制，以期为后续研究提供参考。

1 SHED的干性维持与分化调控

2003年，Miura等[3]从脱落的乳牙残余牙髓中分离出独特的多能干细胞群体。每个脱落的前牙约能形成12～20个细胞集落。较多研究[1-12]表明：与其他来源的MSC相比，SHED表现出更高的增殖速率，且能高度表达几乎所有MSC的表面标记。培养和保存技术对干细胞的持续性研究及应用具有重要意义，目前普遍认为长期冷冻保存乳牙的牙髓组织是一种无害且可行的干细胞临床储备方法。SHED在液氮中冷冻保存2年以上仍能保持最初的干细胞特性[13]。但干细胞经过长期培养也可能面临衰老，长期体外培养和传代的干细胞衰老涉及多种途径，可能与p53、p21和p16Ink4a的表达有关[14]，因此如何维持细胞干性十分重要。研究发现：低氧条件下的培养可能有助于维持SHED的静止状态并增加多能基因（OCT4、SOX2和NANOG）的表达[9]，氯化钴可以协助低氧环境下的SHED保持细胞干性、抑制分化，且无明显细胞毒性[15]。另有研究者[16]尝试构建永生细胞系，Bmi-1诱导的细胞永生化不会影响SHED的主要特征，能长时间传代并稳定表达干细胞特征，是用于长期研究的潜在工具。适当改变SHED的微环境可促进其分化过程。有学者[17]使用成纤维细胞系条件培养基和3D丝素蛋白多孔支架并同时对培养细胞施加机械应力的动态循环系统可促使SHED分化出高活力的干细胞球，其功能性蛋白合成更高。该作者认为：传统细胞培养的共培养物中只有少量生长因子，不足以模拟体外干细胞的分化，而动态循环系统中成纤维细胞系条件培养基生长因子浓度更高，从而避免了向培养基中添加其他化学试剂或生长因子的需求，是促使SHED分化更简便和更经济的一种方法。有研究者[11]通过使SHED稳定表达缺氧诱导因子1α，增强了其血管生成的自分泌和旁分泌信号，具体表现为内皮分化能力增强，形成的脉管系统比用人脐静脉内皮细胞形成的更高，提示了SHED取代人脐静脉内皮细胞成为血管再生种子细胞的潜力。另外，660 nm波长的InGaAlP二极管激光不仅促进SHED增殖，也能使其表达更多血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）、VEGF-A和胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）等血管生成蛋白[18]，发挥促血管生成作用。

2 SHED在口腔组织再生修复中的直接应用

2.1 SHED在牙髓-牙本质复合体再生中的应用

早在2003年，有研究者[3]就发现SHED能分化为成牙本质细胞，但不能形成完整的牙髓-牙本质复合体，即不能形成真正意义上的牙髓组织，该作者认为是其过于“幼稚”的缘故。近年来，研究者们尝试了多种辅助支架以实现牙髓再生，且成功利用SHED构建出了牙髓-牙本质复合体。体外实验证明：SHED结合可注射、可降解支架（肽水凝胶、Ⅰ型胶原蛋白、聚乳酸）[19-21]注入根管后，可以产生功能性的牙髓，表现出与正常牙髓相似的细胞性和血管化，包含成牙本质细胞的牙髓样组织能在整个根管壁以约10 µm·d-1的速度产生新的牙本质，有助于牙髓坏死的年轻恒牙的牙根形成。另外，釉基质蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD）、矿物三氧化物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）和Biodentine能 增 强SHED的细胞活力，增强矿化和牙本质唾液蛋白表达，其中EMD表现最佳[12]。

值得注意的是，SHED与促使其分化的微环境缺一不可，支架本身并不能诱导SHED向牙本质细胞分化，即牙本质来源的信号分子对分化是必需的；而在没有SHED的条件下，信号分子诱导宿主细胞形成的牙髓结构紊乱，提示在无细胞组织工程学中，信号分子可能要结合到支架中，进而从根尖周区主动募集细胞[20]。理想的细胞黏附支架应具有为干细胞提供稳定的附着位点、可缓慢降解和为干细胞提供血管化条件等特点。研究者们试图通过各种方法改造支架从而增强其性能，提高干细胞的黏附率和增殖分化效率，比如通过压缩提高其胶原蛋白密度或在支架上添加生长因子[12,19]，但技术敏感度较高，目前尚未出现临床效果确定的支架材料。而在牙髓血管生成过程中，除了支架和干细胞，另一重要角色则是细胞间的通讯工具如外泌体和细胞因子，诱导SHED成牙本质向分化和形成新生血管。外泌体依托表面的特异性蛋白识别靶细胞如血管内皮细胞，再将囊泡中的促血管生成信号释放到靶细胞中，从而触发一系列级联反应[22]；众多的细胞因子如VEGF等则参与内皮细胞的增殖、迁移，或激活相关信号通路来促进SHED向成牙本质或血管内皮细胞分化，较多研究[23-26]发现：Eph/ephrinB和Wnt/β-catenin信号通路参与SHED向成牙本质细胞分化和血管内皮细胞分化的过程，这些作用最终都促进牙髓-牙本质复合体的形成。

2.2 SHED在牙周组织再生中的应用

有研究[27-28]发现：SHED能刺激单核巨噬细胞向抗炎表型（M2型）巨噬细胞的转化，减少破骨细胞的产生，抑制炎性因子干扰素-γ（interferonγ，INF-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）表达，从而减少牙龈出血，增加牙周膜新附着的产生，缩短釉牙骨质界与牙槽嵴顶之间的距离，这项研究利用大鼠牙周炎模型证明了SHED的局部传递得益于M2巨噬细胞极化的诱导。进一步地，SHED联合牙本质基质成功移植实现了牙周组织的体内再生，该牙周组织由新生的牙周膜、血管和牙槽骨组成[29]。有研究者[8]认为：SHED对牙周炎的抑制作用可能与其在促炎细胞因子刺激下高表达的β-防御素4有关，β-防御素4具有抗炎和抗菌活性，对牙龈卟啉单胞菌敏感，还能通过调节Notch途径增强SHED的成骨和成牙本质细胞分化潜能。SHED移植为牙周-牙髓联合病变和再植牙的牙周膜愈合提供了新的解决思路，需要进一步工作去探究其可行性及有效性。

2.3 SHED在骨再生中的应用

相比于其他来源的MSC，SHED在成骨条件培养下旁分泌活性更强，促血管生成特征更明显[3,14,30-33]，有利于类骨质的生成。与人牙髓干细胞和骨髓MSC相比，其在重建牙槽骨时，新生的类骨质最多、胶原纤维分布最广泛[31]，不仅早期类骨质生成速度快，还可增强晚期骨矿化程度，可能是因为SHED分泌的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrobast growth factor，bFGF）通过平衡磷酸盐和焦磷酸盐的比例从而调控矿物质沉积的量[33]，而体外添加不同浓度的氯己定则会在一定程度上抑制SHED的矿化潜力[34]。

为了提高SHED的成骨分化效率，较多研究旨在创造最适合的成骨分化的微环境，涉及多种新型材料、技术、支架和生长因子的联合使用。有研究者[10]使用间接亲和力固定技术将Notch配体Jagged-1和Delta样配体蛋白（delta-like 1 protein，Dll-1）固定在组织培养表面，在接种于Jagged-1表面的细胞群中，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的量及活性、Ⅰ型胶原蛋白表达和矿化作用显著增加，而接种于Dll-1表面的细胞群促进成骨分化效果不明显。另有实验[35]证明：氧化石墨烯量子点诱导了SHED的成骨分化，而氧化石墨烯呈现轻微抑制作用，这与石墨烯衍生物的浓度、合成方法和氧化程度都有密切关系，该作者认为SHED的成骨分化途径是通过吸收氧化石墨烯衍生物从而使细胞质中β-catenin的蛋白水平上调，并激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。

许多研究者[13,25]为了验证SHED的成骨作用开展了动物实验，结果发现：利用羟磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）移植载体能重建骨小梁，改善骨质疏松和修复免疫受损小鼠的颅骨缺损；同时，碳酸盐磷灰石支架生物相容性强，具有诱导骨生成和骨传导的能力，能诱导出适合成骨分化的微环境，可能和骨蛋白酶和核因子κb受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）的表达情况有关[36]。还有学者[37]自制可快速降解的钙磷纤维支架，利用了月桂酰氯提高矿物相在聚左旋乳酸（poly-l-lactic acid，PLLA）聚合物基质中的分散性，并结合不影响材料力学性能的电纺丝法，研究证明适合乳牙干细胞生长。另外，有研究者[5]将SHED植入拔牙位点，结果发现：其能明显修复牙槽骨缺损，增强骨重建过程中骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）和BMP-7的表达，同时减弱基质金属蛋白-8（matrix metalloproteinases-8，MMP-8）的表达。但值得思考的是，这种适合分化的微环境也会受到本身病理条件的影响，如何让SHED在炎症环境中保持高效的增殖分化和旁分泌活动仍需要更深入的研究。

3 SHED在口腔组织再生修复中的其他应用

3.1 SHED在神经保护中的应用

由于SHED与中枢神经系统同源，因此其表现出极好的神经分化潜力，能表达与神经保护、轴突伸长和神经祖细胞有关的蛋白，对神经变性和炎症都有治疗作用[1,7,38-39]。Kitase等[38]探究了SHED对大鼠缺氧缺血性脑病的治疗效果，在静脉用药的情况下，受损皮层只检测到少量的SHED，即使如此，M1型小胶质细胞的比例也明显降低，而M2型增加，伴随明显降低的炎性反应，在后续行为测试中大鼠的肢体活动性和耐力都表现更好。进而，作者用氧和葡萄糖缺乏的神经元培养实验证实了SHED的神经保护作用。在脑外伤小鼠模型中，SHED可以显著减少活化小胶质细胞释放的炎症因子如白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和TNF-α。同时，外伤中产生的具有神经毒性的亚硝酸盐浓度降低，可能与无细胞分泌物中外泌体的调节有关[39]，相比于使用SHED共培养系统，纯化的外泌体本身可能对炎症的减轻作用更大。

3.2 SHED在免疫调节中的应用

损伤修复和组织再生离不开炎症的控制，目前较多研究支持MSC的炎症调节作用是一把“双刃剑”，包括抗炎和促炎作用，在炎症反应强烈的情况下，口腔MSC通过直接接触或旁分泌效应调节炎症细胞、炎症细胞因子，RANKL/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和破骨细胞来抑制炎症产生和骨吸收，防止免疫反应过度表达；当处于低炎症水平时，口腔MSC可促进炎症产生和骨骼吸收[40]。MSC影响多种免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞（包括CD3+、CD4+和CD8+、T淋巴细胞、调节性T细胞等）的活动，它们的相互作用调节了局部炎症微环境，但也可能影响MSC的迁移、归巢、增殖和分化能力[6,40]，涉及的多种炎症因子较为复杂，尚不明确。有研究者认为SHED在免疫治疗中相对于其他MSC较有优势。首先，其受免疫细胞影响较小，Whiting等[41]测定了不同口腔干细胞对活化自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）毒性的敏感度，结果发现：SHED在多种浓度的NK细胞环境中都能保持较好的活性，且在体内抑制辅助型T细胞2（T helper 2 cell，Th2）免疫应答和在体外诱导调节性T细胞扩增方面都优于骨髓源的MSC[6]。

4 小结

综上所述，SHED在口腔组织再生修复的应用中有许多优势，如易取、无创、较少伦理争议，且可以实现牙髓-牙本质复合体和牙周组织再生，并发挥神经保护和炎症控制等多方面作用。但在SHED的临床应用前还有许多需要考虑的地方，如有研究[42]发现：镓铝砷化镓（GaAlAs）二极管激光照射、次氯酸钠、臭氧水和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）对SHED可能存在细胞毒性作用，作用大小还需取决于具体的剂量和浓度，所以研究者应思考清理根管的材料是否影响SHED的活性。另外，即使低剂量的锥形束CT（cone beam CT，CBCT）检查也有潜在风险，电离辐射会导致SHED的DNA损伤和持续的炎症反应[43]，这使得可行的判定疗效的方法十分重要。除了SHED移植治疗外，干细胞的外泌体作为干细胞发挥作用的重要介质，可以发挥和干细胞相似的疗效，从而作为一种无细胞治疗策略为再生医学领域提供一种新的思路，SHED衍生的外泌体的无细胞治疗可能也是一种理想的口腔组织再生与修复方式。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。