复方木芙蓉涂鼻软膏治疗变应性鼻炎的临床疗效及其网络药理学研究

何俐莹，陶雪莹，岑超

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎、变态反应性鼻炎。是一种吸入外界过敏性抗原而引起的、以鼻痒、打喷嚏、流清涕等为主要症状的疾病［1］。AR是儿童极为常见的一种慢性鼻黏膜充血的疾病，鼻痒是本病的重要特征；过敏发作期还会出现眼部过敏症状；呼吸道过敏严重的病儿还会出现过敏性咳嗽和哮喘［2］。

中医将变态反应性鼻炎归为“鼻鼽”的范围，鼽，古籍中指鼻塞不通，也指鼻子流清涕，在此取意后者。中医认为AR多发于肺、脾、肾三脏的虚弱，其主要包括肺气虚、脾气虚、肾阳不足等证［3］；而西医认为AR是个体接触过敏原后由免疫球蛋白-E（IgE）介导的超敏反应，由多种细胞因子和炎性因子共同参与的鼻黏膜慢性非感染性炎症。复方木芙蓉涂鼻软膏（MNO）是贵州苗族验方，由木芙蓉叶、地榆两味中药组成，具有解表通窍，清热解毒的功效，现代临床常应用于干燥性鼻炎［4］、变应性鼻炎［5］、急性鼻炎［6］等多种鼻腔疾病［7］。现代药理研究表明，复方木芙蓉涂鼻软膏可以降低小鼠耳郭肿胀，并且能显著抑制二甲苯致小鼠耳毛细血管通透性增高及对抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高，具有良好的抗炎作用。但复方木芙蓉涂鼻软膏组方成分复杂，作用靶点多，而目前尚无复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的有效靶点及信号通路的研究。

本研究分析了重庆医科大学附属妇女儿童医院采用复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的临床疗效，并利用网络药理学分析其潜在的关键靶点及作用机制，为其以后的临床及基础研究提供可靠的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择重庆医科大学附属妇女儿童医院2019年10月至2020年12月确诊为AR的病人130例，其中男性68例，女性62例；年龄范围6～12岁；病程范围4～12周，按数字表法将入选的病人分为对照组和治疗组两组，每组分别65例；两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。病人及其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求

表1 两组变应性鼻炎130例一般资料比较

1.2 西医诊断标准参照《变应性鼻炎的诊治原则和推荐方案（2004年，兰州）》［8］，临床症状：①打喷嚏、清水样涕、鼻塞、鼻痒等症状出现2项以上，每天症状持续或累计1 h以上，可伴有眼痒、流泪和眼红等眼部症状；②体征：常见鼻黏膜苍白、水肿，鼻腔水样分泌物；③变应原检测：至少一种变应原皮肤点刺实验（SPT）和（或）血清特异型IgE阳性。

1.3 中医诊断标准参照《中医临床诊疗指南-耳鼻咽喉疾病分册》［9］，本病分为四类证候：①肺气虚寒证：发作性鼻痒，喷嚏连作，清涕量多，鼻塞，嗅觉减退；鼻黏膜色淡、肿胀；语声低，易患感冒，经常咳嗽、咳痰；舌淡红，苔薄白，脉细弱。②脾气虚弱证：发作性鼻痒，喷嚏连作，清涕量多，鼻塞，嗅觉减退；鼻黏膜色淡、肿胀；食少，便溏，倦怠乏力；舌淡红或胖，边有齿痕，苔薄白，脉细弱。③肾阳不足：发作性鼻痒，喷嚏连作，清涕量多，鼻塞，嗅觉减退；鼻黏膜苍白、肿胀；畏寒，肢冷，腰膝酸软；舌淡，苔白，脉沉细。④肺经伏热证：发作性鼻痒，喷嚏连作，清涕量多或为黏稠涕，鼻塞，嗅觉减退；鼻黏膜偏红、肿胀；口干；舌红，苔薄白或薄黄，脉数。

1.4 纳入标准①符合变态反应性鼻炎中∕西医诊断标准；②至少有2个主要症状；③2周内未接受抗过敏药或免疫调节药物。

1.5 排除标准①非变态反应性鼻炎；②患上、下呼吸道感染，及其他鼻部疾病；③近1个月用过肾上腺糖皮质激素，或2周内进行过变应性鼻炎治疗；④正在使用大环内酯类抗生素和（或）系统使用咪唑类抗真菌药者。

1.6 退出（脱落）标准①对复方木芙蓉涂鼻软膏出现或疑似过敏反应或严重不良事件；②治疗过程中，出现其他情况不宜继续使用；③病人依从性差，未遵医嘱用药者，或自动中途换药者；

1.7 治疗方法对照组采用丙酸氟替卡松鼻喷雾剂（葛兰素史克集团公司，辅舒良50 μg×120喷）治疗，观察组采用复方木芙蓉涂鼻软膏（贵州良济药业有限公司），早晚各1次，取长约1 cm涂于鼻腔内，治疗疗程4周。

1.8 观察指标观察对比病人用药前后尿中白三烯E4（LTE4）以及血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-4、IL-6、IL-12等炎性因子水平。

1.9 疗效评价标准根据症状记分评定疗效。观察病人用药前后的主要症状变化情况：①鼻塞：主要以口呼吸为4分；需用口辅助呼吸为3分；用鼻子勉强自主呼吸为2或1分。②鼻痒：无法忍受为4分；持续性鼻痒可耐受为3分；间歇性鼻痒可耐受为2分；偶有鼻痒为1分。③打喷嚏：1次连打喷嚏个数≥11个为4分；6～10个为3分；3～5个为2分，1～2个为1分。④流涕：每日流涕次数≥10次为4分；5～9次为3分；≤4次为1～2分。⑤眼痒流泪：持续眼痒流泪为3分；间歇性眼痒流泪为2分；偶有眼痒流泪为1分。症状改善百分率＝（治疗前总分-治疗4周后总分）∕治疗前总分×100%。①显效：症状改善百分率≥66%；②有效：症状改善百分率26%～65%；③无效：症状改善百分率≤25%。

1.10 基于网络药理学研究利用TCMSP数据库（https：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）、UniProt数 据 库（https：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards数 据 库（https：∕∕www.genecards.org∕）、STRING数 据 库（https：∕∕string-db.org∕）、DrugBank数 据 库（https：∕∕www.drugbank.ca∕）对复方木芙蓉涂鼻软膏潜在有效成分进行筛选［10-11］，化合物筛选标准：DL≥0.18［12-14］或符合Lipinski类药性五原则。通过OMIM数据库、GeneCards数据库、DrugBank数据库，以Allergic rhinitis为关键词，同时以来源为人类（homo sapiens）为条件，检索和筛选AR相关的靶点。将每个化合物与其作用的AR靶点相联系，采用Cytoscape 3.7.1软件进行复方木芙蓉涂鼻软膏的成分-AR相关靶点相互作用网络的构建并绘制网络图。采用R语言中的Bioc-Manager包对复方木芙蓉涂鼻软膏活性成分和AR共同靶点进，基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

1.11 统计学方法数据采用SPSS 20.0统计学软件处理，其中症状积分数据采用非参数秩和检验；计量资料用±s表示，采用t检验，计数资料用例（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较治疗4周后，观察组的总有效率明显高于对照组，两组临床总有效率差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组变应性鼻炎130例临床疗效比较∕例（%）

2.2 两组治疗前和治疗4周后尿中LTE4水平治疗前，观察组与对照组比较差异无统计学意义，治疗4周后，两组尿LTE4水平均显著低于治疗前（P＜0.001）。治疗后，对照组、观察组TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表达水平均出现显著下降，组间相比，采用复方木芙蓉涂鼻软膏的观察组TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 两组变应性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子变化比较

表3 两组变应性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子变化比较

注：LTE4水平为白三烯E4水平，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-4为白细胞介素-4，IL-6为白细胞介素-6，白细胞介素-12为IL-12。

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2.3 活性化合物的筛选及其靶点预测通过筛选，共得到9个主要活性成分，包括山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、丁子香萜、2，3，8-三邻甲基鞣花酸等，见表4。通过变应性鼻炎靶点筛选，得到AR相关靶点3 715个，复方木芙蓉涂鼻软膏药物靶点基因146个，并且得到复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的潜在靶点117个，其结果见图1-Venn diagram。

表4 复方木芙蓉涂鼻软膏的9个主要活性成分

2.4 靶点PPI网络、关键基因分析将117个潜在靶点倒入String数据库，进行蛋白互作分析，最后使用String绘制软件构建复方木芙蓉涂鼻软膏蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，见图2。Degree值越大表示该靶点为AR疾病的关键靶点，与AR密切相关，选取Degree值前10的关键靶点，构建其关键靶点的PPI网络，见图3，4。前10个疾病靶点如下：AKT1、IL6、ALB、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、MAPK1、MYC，表明前10个靶点在复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR过程中起关键性作用。

2.5 成分-靶点-通路网络构建采用Cytoscape 3.7.1软件，构建了复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR成分-靶点-通络网络图，见图5。其中绿色为活性成分，紫色为化合物作用的靶点，其中作用靶点117个，提示这些蛋白可作为复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的潜在靶点。

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析为解释复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的作用机制，采用R语言对复方木芙蓉涂鼻软膏活性成分和AR共同靶点进行GO分析（图6），共获得117条GO生物学过程，其主要包括核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、四曲吡咯结合、氧化还原酶活性等，表明复方木芙蓉涂鼻软膏可以通过多种生物学调控过程发挥治疗AR的作用。

KEGG通路富集显示复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR关键基因靶点主要富集通路有108条，主要涉及流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、辅助性T细胞17信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、甲型流感通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等，根据P≤0.05选取排名靠前的30条通路，见表5。

表5 复方木芙蓉涂鼻软膏治疗变应性鼻炎KEGG富集分析结果

3 讨论

变应性鼻炎发生机制和辅助性T淋巴细胞亚群Th1∕Th2平衡、炎性因子异常表达关系密切，炎性因子异常不仅在变应性病变过程中具有关键作用，而且其对疾病预后有一定影响［15］。在Th1∕Th2平衡中，Th1主要释放Th1型细胞因子γ干扰素（IFN-γ）、IL-2抑制Th2释放的炎性因子TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12，从而控制机体的免疫应答。本研究治疗后，两组的TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12均有显著下降，说明在治疗之后，病人体内炎症反应多得到有效抑制，进一步对组间数据对比发现，使用复方木芙蓉涂鼻软膏的观察组炎症抑制效果显著优于常规治疗的对照组，说明其具有抑制炎症反应的效果。并且药物可降低变应性鼻炎病人尿LTE4水平，提示其一方面可能通过干预的生物合成或作用于白三烯（LTs）受体，抑制LTs的释放，从而降低对中性粒细胞、嗜酸粒细胞及单核细胞等的趋化作用，使作用于鼻腔黏膜的炎症介质、细胞因子的数量降低，炎性细胞聚集、浸润减少，从而达到减少鼻腔炎症反应的作用，从而达到缓解AR发作的目的。本研究中，将复方木芙蓉涂鼻软膏直接涂于病人鼻腔黏膜，药物成分可被鼻腔黏膜快速吸收，直接作用于鼻腔黏膜肥大细胞等致敏细胞，改善细胞功能，在达到快速缓解症状的同时，减少药物用量，避免不良反应发生。若将其涂抹于身体其他部位，其效果明显不如涂抹于鼻腔黏膜处。本研究治疗期间，观察组所有病人未见鼻腔黏膜损伤或黏膜功能减退者，说明将复方木芙蓉涂鼻软膏直接涂于病人鼻腔黏膜具有较高的安全性。而长期大量使用丙酸氟替卡松等激素类药物则易导致声嘶、鼻衄等多种不良反应。

通过筛选，共得到9个主要活性成分，其中槲皮素可抑制一氧化氮（NO）、前列腺素D2（PGD2）、环氧化酶-2（COX-2）的水平，并通过抑制核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路发挥抗炎作用［16］；山柰酚能够有效降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶-4（NOX4）、吞噬细胞NADPH氧化酶的一个亚单位p67phox蛋白的表达量，从而发挥抗氧化作用［17］。胡萝卜甙功能广泛，具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用［18］。2，3，6-O-三没食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-双没食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2，3，8-三邻甲基鞣花酸是地榆中糖苷类成分，有研究表明，有研究发现地榆中的抗炎活性物质是糖苷类化合物，能显著降低IL-1β水平，升高IL-10水平，且明显下调NFκB蛋白活性，具有明显的抗炎效果［19-20］。

变应性鼻炎是变应原进入人体后，经巨噬细胞等抗原呈递细胞处理后，产生IgE抗体，附着于肥大细胞等的细胞膜上，因而使鼻黏膜致敏。当变应原再次进入人体时，与IgE结合，使肥大细胞膜变构，释放出大量生物活性介质如组胺、白三烯、嗜酸性粒细胞趋化因子、血小板活化因子、TNF-α、IL-4，IL-6及IL-12等［21］。本研究治疗后，观察组的总有效率明显高于对照组，说明复方木芙蓉涂鼻软膏治疗变应性鼻炎可有效改善病人临床症状。丙酸氟替卡松可经抑制白细胞、巨噬细胞等释放细胞因子，发挥抗过敏、抗炎作用，达到缓解临床症状的目的。与丙酸氟替卡松治疗变应性鼻炎相比较，复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR机制更加复杂。网络药理学研究表明，复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR可能是通过PTGS2、IL-6、MAPK1、VEGFA等关键靶点发挥作用，其中PTGS2与炎症和有丝分裂发生相关的前列腺素生物合成有关，MAPK蛋白激酶调控着炎症反应等多种重要的细胞生理∕病理过程，其中P38MAPK∕NF-κB通路是经典的炎症免疫通路，是一种重要的炎症调控因子［22-23］。复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR可能参与调控AGE-RAGE、TNF、IL-17炎性因子通路等多条通路信号，通过控制其中炎性因子的释放、激素的水平、Th1∕Th2平衡来对AR起治疗作用。本研究的临床研究也证实，复方木芙蓉涂鼻软膏可降低AR病人TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12炎性因子水平，从而改善其症状。本研究因治疗时间相对较短，所得结果可能存在一定偏差。

综上所述，采用网络药理学结合临床研究，初步阐明了复方木芙蓉涂鼻软膏治疗AR的作用机制，可能是通过作用于PTGS2、IL-6、MAPK1等靶点参与调控AGE-RAGE、TNF、IL-17等信号通路，发挥控制炎症的作用，从而控制AR的发生，此为后续复方木芙蓉涂鼻软的药理机制分析和实验验证提供了理论支撑。

（本文图1～6见插图1-7）