微小RNA-646对胶质母细胞瘤细胞系U251增殖和转移的影响

张传政，常欣辛，张晓东，费帆

胶质母细胞瘤是常见的颅内肿瘤，较高的侵袭力、恶性程度和复发率使其病人预后不佳［1］。微小RNA（miRNAs，miR）参与包括胶质母细胞瘤在内的多种肿瘤的发生发展［2-4］。miR-646是miR-15∕107基因群成员，最初在人大脑白质和灰质中发现，近年来被证实在肺腺癌、结直肠癌和胃癌等多种肿瘤中异常低表达，与肿瘤大小、淋巴结转移和分期等有关，在肿瘤进展中miR-646充当抑癌基因［5-7］。有学者通过癌症基因组图谱筛选563例胶质母细胞瘤病人的miRNA表达谱，发现miR-646的低表达与胶质母细胞瘤病人的不良预后相关［8］，然而miR-646在胶质母细胞瘤中的表达及作用并不明了。因此，本研究假设miR-646同样充当抑癌因子参与胶质母细胞瘤的进展。本研究以人胶质母细胞瘤细胞系U251为研究对象，旨在探讨miR-646对U251细胞恶性行为的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料2018年5月至2019年5月，正常星形胶质细胞HNAs、人胶质母细胞瘤细胞系SHG44、A172和U251（中科院上海细胞库），胎牛血清（杭州四季青），青链霉素混合液（北京索莱宝），1640培养基、胰蛋白酶、Trizol试剂、脂质体2000和MTT试剂（美国Invitrogen），二甲基亚砜（上海博光生物），miR-646模拟物、miR-646抑制剂及其相应对照（广州锐博生物）。上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和β-肌动蛋白（βactin）抗体（美国CST），叉头框K1（forkhead box K1，FOXK1）抗体（上海钰博生物），辣根过氧化酶标记的二抗（北京中杉金桥）。Bradford法蛋白检测试剂盒（联科生物），双荧光Luciferase检测试剂盒（美国Promega），反转录试剂盒（日本Takara）。实时荧光定量PCR仪和二氧化碳培养箱（哈尔滨东联电子），倒置显微镜（英国BioPulverizer），PCR扩增仪和凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad）。

2014年1月至2016年1月，从成都市第六人民医院采集了14对神经胶质瘤样本和相邻的非肿瘤样本，然后在液氮中速冻并保存在-80℃用于RNA的提取和检测。根据WHO对中枢神经系统肿瘤的分类，对所有参与本研究的病人进行了组织学诊断。所有病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将U251细胞接种至1640培养基（含10%胎牛血清和1%青链霉素）上，常规培养。待生长至80%融合时，以1∶3比例进行传代，第3代细胞用于实验。

1.2.2 分组与转染将U251细胞接种在6孔板（100 000个∕孔）中，培养至80%汇合度时进行转染，分为六组：①模拟物对照组：模拟物阴性对照转染细胞；②miR-646模拟物组：miR-646模拟物转染细胞；③抑制剂对照组：转染miR-646抑制剂对照；④miR-646抑制剂组：转染miR-646抑制剂；⑤miR-646模拟物+pcDNA-FOXK1组：共转染miR-646模拟物和FOXK1过表达质粒pcDNA-FOXK1；⑥miR-646模拟物+pcDNA组：共转染miR-646模拟物和过表达空载质粒pcDNA。转染4 h后，更换培养基。再培养48 h后，收集各组细胞进行指标检测。每组3个重复。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测miR-646表达Trizol法提取组织∕细胞总RNA，将RNA逆转录互补DNA（cDNA）进行扩增。PCR反应体系：1 μL cDNA、10 μL SYB Green、正反向引物各0.5 μL，加去离子水补至20 μL。反应过程为95℃预变性1 min后，进入40个循环过程：95℃、10s，60℃、40s，72℃、30s。2-ΔΔCt法计算miR-646的相对表达量，U6为内参。引物序列如下：miR-646正向5'-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3'，反向5'-CTCAACTGTGCTGCATTAGTTAGCTCAGA-3'；U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖将对数生长期U251细胞根据“1.2.2”中的分组转染48 h后，胰酶消化收集各组细胞，并接种至96孔板上（5 000个细胞∕孔），培养24 h、48 h和72 h后，加入MTT溶液（5 g∕L，每孔20 μL），孵育4 h后，加入二甲基亚砜（每孔150 μL）溶解甲瓒晶体，检测各孔吸光度值。

1.2.5 克隆形成实验将对数生长期U251细胞根据“1.2.2”中的分组转染后，胰酶消化收集各组细胞，以每孔800个细胞接种至6孔板中，并保持14 d以上。当细胞克隆可见时，用0.1%结晶紫溶液染色，于显微镜下计数克隆形成数（大于50个细胞）。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭、迁移将各组U251细胞用无血清培养基重悬并调整为1 000 000个细胞∕毫升。侵袭实验时前，使用50 mg∕L的Matrigel基质胶铺于Transwell小室底部膜上，并在4℃下风干。迁移实验则直接使用无基质胶包被的小室。将小室放入24孔板内，取200 μL细胞悬液加入上室，600 μL培养基（含胎牛血清）加入到下室。培养24 h后，取出小室，将上室膜表面内细胞擦去，膜下表面细胞用乙醇固定30 min后，用0.5%结晶紫染色15 min。于显微镜下计数穿膜细胞数。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移胰酶消化收集各组细胞，以每孔2 000个细胞接种于6孔板中，并将细胞保持在37℃，5%二氧化碳中直至细胞长满培养板。然后，将200 μL微量移液器在培养板中垂直划直线，创建伤口区域。分别于划痕后即刻和48 h计算划痕愈合率［9］，评估细胞的迁移能力。

1.2.8 蛋白质印迹法检测细胞中FOXK1和上皮间质转化相关蛋白表达向U251细胞中加入细胞裂解液裂解提取总蛋白，测定总蛋白浓度后，SDSPAGE分离蛋白样品（50 μg），并转膜。将膜用5%脱脂奶粉封闭2 h后，与一抗工作液（E-cadherin 1∶200、N-cadherin 1∶500、Vimentin 1∶1 000和FOXK1 1∶1 000）在4℃下孵育24 h，再与二抗（1∶5 000）在室温下孵育2 h。化学发光剂显影后，采用凝胶成像系统扫描并分析蛋白条带的灰度值，β-actin为内参。

1.2.9 双萤光素酶报告基因实验检测miR-646和FOXK1的靶向关系将FOXK1的3'UTR片段克隆并重组至pGL3-basic萤光素酶报告基因载体上，将其作为FOXK1野生型载体；另外，将miR-646与突变后的FOXK1 3’UTR克隆重组至pGL3-basic萤光素酶报告基因载体上构建FOXK1突变型载体。将构建的FOXK1野生型和FOXK1突变型载体参照脂质体2000说明书分别与miR-646模拟物、模拟物对照或miR-646抑制剂、抑制剂对照共转染至U251细胞中，转染48 h后，收集细胞检测萤光素酶活性。

1.3 统计学方法每组3个复孔，实验重复3次。结果以±s表示，SPSS 22.0软件用于统计学分析，采用独立样本t检验用于两组间比较，单因素方差分析和SNK-q检验用于三组及以上的组间两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-646在胶质瘤组织中的表达胶质瘤组织中miR-646表达水平0.36±0.03明显低于正常脑组织1.00±0.06（t=16.53，P＜0.001）。

2.2 miR-646在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中的表达与HNAs细胞（1.00±0.08）相比，胶质瘤细 胞SHG44、A172和U251（0.54±0.04、0.63±0.06、0.38±0.04）中miR-646表达水平显著降低（P＜0.05），其中U251细胞差异最显著。

2.3 转染后各组U251细胞中miR-646表达与模拟物对照组（1.00±0.11）相比，miR-646模拟物组（5.28±0.53）miR-646水平升高（P＜0.05）；与抑制剂对照组（1.00±0.10）相比，miR-646抑制剂组（0.24±0.03）miR-646水平降低（P＜0.05）。

2.4 miR-646对U251细胞增殖的影响与各自非特异性对照相比，miR-646模拟物组细胞在24 h、48 h和72 h的增殖活力明显降低，细胞克隆形成数明显减少，而miR-646抑制剂组细胞的增殖活力明显增强，细胞克隆形成数显著增加（P＜0.05）。见表1，图1。

表1 miR-646对U251细胞增殖的影响

表1 miR-646对U251细胞增殖的影响

注：①与模拟物对照组相比，P＜0.05。②与抑制剂对照组相比，P＜0.05。

组别模拟物对照miR-646模拟物抑制剂对照miR-646抑制剂F值P值重复次数3 3 3 3吸光度（570 nm）24 h 0.72±0.06 0.45±0.03①0.81±0.05 1.06±0.11②39.83＜0.001 48 h 1.22±0.13 0.86±0.05①1.16±0.09 1.47±0.20②11.17 0.003 72 h 1.64±0.23 1.05±0.09①1.57±0.15 2.12±0.31②12.81 0.002细胞克隆形成数∕个102.44±9.14 51.24±5.36①98.65±8.36 165.22±11.23②85.15＜0.001

2.5 miR-646对U251细胞侵袭的影响与各自非特异性对照（75.36±6.62）相比，转染miR-646模拟物可使U251细胞侵袭能力明显减弱（75.36±6.62比46.55±3.16），而转染miR-646抑制剂后U251细胞侵袭 能 力明显增 强（68.82±7.05比101.25±9.95，P＜0.05）。见图2。

2.6 miR-646对U251细胞迁移的影响与各自非特异性对照相比，转染miR-646模拟物可使U251细胞迁移能力明显减弱，划痕愈合率显著降低，而转染miR-646抑制剂后U251细胞迁移能力明显增强，划痕愈合率显著升高（P＜0.05）。见表2，图3。

表2 各组中迁移细胞数的比较

表2 各组中迁移细胞数的比较

注：①与模拟物对照组相比，P＜0.05。②与抑制剂对照组相比，P＜0.05。

组别模拟物对照miR-646模拟物抑制剂对照miR-646抑制剂F值P值重复次数3 3 3 3迁移细胞数∕个151.28±13.50 98.75±8.82①135.46±11.65 182.32±15.24②23.09＜0.001划痕愈合率∕%46.21±4.22 20.13±2.65①40.58±4.69 69.52±5.14②67.58＜0.001

2.7 miR-646对U251细胞上皮间质转化的影响与各自非特异性对照相比，miR-646模拟物可明显促进U251细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白表达，且显著抑制间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表达（P＜0.05）；而miR-646抑制剂作用结果恰好与miR-646模拟物结果相反，可明显抑制E-cadherin并 促 进N-cadherin和Vimentin蛋 白 的 表 达（P＜0.05）。见表3，图4。

表3 各组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的比较s

表3 各组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的比较s

注：E-cadherin为上皮钙黏素，N-cadherin为神经钙黏素，Vimentin为波形蛋白。①与模拟物对照组相比，P＜0.05。②与抑制剂对照组相比，P＜0.05。

组别模拟物对照miR-646模拟物抑制剂对照miR-646抑制剂F值P值重复次数3 3 3 3 E-cadherin 0.38±0.03 0.66±0.04①0.36±0.03 0.14±0.02②143.47＜0.001 N-cadherin 0.47±0.03 0.21±0.02①0.52±0.04 1.19±0.12②121.04＜0.001 Vimentin 0.55±0.04 0.18±0.03①0.50±0.03 0.72±0.06②87.24＜0.001

图4 蛋白质印迹法检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达

2.8 FOXK1是miR-646的 靶 基 因Targetscan数据库预测到FOXK1的3'UTR区域存在miR-646的结合位点。双萤光素酶实验发现，与各自非特异性对照相比，miR-646模拟物可使转染FOXK1 3'UTR野生型质粒的U251细胞萤光素酶活性降低（P＜0.05），而miR-646抑制剂处理则得到相反的结果，可升高细胞的萤光素酶活性（P＜0.05）；但是，miR-646模拟物或抑制剂与FOXK1 3'UTR突变型质粒共转染的U251细胞萤光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。与各自非特异性对照相比，miR-646模拟物可明显抑制U251细胞中FOXK1蛋白表达（P＜0.05）；而miR-646抑制剂作用结果恰好与miR-646模拟物结果相反，可明显促进FOXK1蛋白的表达（P＜0.05）。见表4，图5。

表4 各组细胞萤光素酶活性和FOXK1蛋白水平比较s

表4 各组细胞萤光素酶活性和FOXK1蛋白水平比较s

注：FOXK1为叉头框K1。①与模拟物对照组相比，P＜0.05。②与抑制剂对照组相比，P＜0.05。

组别模拟物对照miR-646模拟物抑制剂对照miR-646抑制剂F值P值重复次数3 3 3 3萤光素酶活性FOXK1-野生型1.00±0.12 0.29±0.02①1.00±0.11 4.21±0.42②181.91＜0.001 FOXK1-突变型1.00±0.13 0.93±0.08 1.00±0.10 0.96±0.09 0.34 0.800 FOXK1蛋白0.51±0.04 0.28±0.03①0.55±0.03 0.92±0.06②120.29＜0.001

图5 miR-646靶向调节FOXK1表达：A为Targetscan数据库预测的FOXK1与miR-646的结合位点；B为FOXK1蛋白表达

2.9 FOXK1过表达逆转了miR-646过表达对U251细胞增殖和转移的作用与miR-646模拟物+pcDNA相 比，miR-646模 拟 物+pcDNA-FOXK1组可明显提高U251细胞24 h、48 h和72 h的增殖活力、细胞克隆形成数，明显增强细胞的侵袭、迁移能力，明显增加划痕愈合率（P＜0.05）。见表5，图6。

表5 FOXK1过表达逆转了miR-646过表达对U251细胞增殖和转移的作用∕xˉ±s

3 讨论

目前，胶质母细胞瘤的治疗仍以手术切除和放化疗为主，但由于肿瘤内和肿瘤间异质性的存在，使其治疗易产生药物抗性和复发；鉴于中枢神经系统的复杂性和肿瘤细胞的高侵袭性，有效的治疗方案是一直是胶质母细胞瘤临床治疗的重要需求［10］。miRNAs是内源性非编码RNA，影响多数生物学过程，如细胞增殖、转移等，与胶质母细胞瘤发生发展密切相关［11-12］，而寻找和确认能够改善胶质母细胞瘤恶性进展的miRNA对其治疗具有重要意义。

miR-646是miRNAs中重要一员，被证实与肿瘤的发生发展密切相关。胃癌组织中miR-646的表达与邻近的正常组织相比明显下调，且低表达的miR-646与胃癌的恶性程度密切相关；上调其表达不仅可抑制肿瘤细胞的生长和迁移，还可抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化［7］。在骨肉瘤发病机制的研究中发现，miR-646可通过靶向调控表皮生长因子受体抑制U2OS细胞增殖和迁移［13］。另外，miR-646高表达可还调控EGFR∕Akt通路抑制肺癌A549细胞增殖扩散［14］。之后，miR-646还在肝癌［15］和子宫内膜癌［16］等肿瘤中有报道。目前，关于miR-646是否参与胶质母细胞瘤的发病机制并不清楚。本研究体外细胞实验结果显示，上调miR-646表达减弱胶质母细胞瘤U251细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移能力并延缓上皮间质转化进程；而下调miR-646表达则表现出相反作用。提示，miR-646可抑制U251细胞的恶性行为，在胶质母细胞瘤发生发展过程中发挥着重要的抑癌作用。

Fox基因家族是细胞内重要的转录因子，在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用［17-18］。FOXK1是FOX家族成员，在多种肿瘤中异常高表达，参与细胞增殖、上皮间质转化、浸润和转移，如胃癌、食管癌和肝癌［19-21］。已有研究证实，FOXK1在胶质母细胞瘤组织和细胞中异常高表达，且可通过增强S期细胞群促进细胞增殖，激活Snail转录加快细胞上皮间充质转化和转移［22］。另外，有研究指出在胃癌中miR-646可通过靶向调控FOXK1抑制癌细胞增殖和转移［23］。由此可见，FOXK1在胶质瘤等肿瘤中充当癌基因，促进癌症进展。在本研究中，FOXK1被预测是miR-646的潜在靶基因，双萤光素酶实验证实miR-646与FOXK1 3’UTR存在靶向调控关系；蛋白质印迹法结果显示，miR-646过表达可降低FOXK1蛋白水平，而敲低miR-646则有相反作用，进一步证实了FOXK1是miR-646靶基因。为了进一步探索靶向FOXK1是否是miR-646调控胶质瘤发生发展的重要途径，本研究在胶质瘤U251细胞中同时转染miR-646模拟物和FOXK1过表达质粒pcDNAFOXK1，结果显示，FOXK1过表达可明显减弱miR-646过表达对U251细胞恶性进展的影响。这些结果提示，miR-646可能通过靶向调控FOXK1表达介导细胞增殖和转移。

综上所述，miR-646过表达可能通过靶向负调控FOXK1表达抑制U251细胞增殖和转移。本研究仅从单种胶质母细胞瘤细胞系和细胞水平上初步阐述了miR-646的作用，还需在多种肿瘤细胞系和动物水平上进一步验证；同时miR-646抑制胶质母细胞瘤发生发展的分子机制十分复杂，还有待进一步深入研究。

（本文图1～3，6见插图1-6）

图1 各组细胞的克隆形成（结晶紫染色×10） 图2 各组U251细胞的侵袭（结晶紫染色×200） 图3 各组U251细胞的迁移：3A为Transwell小室实验（结晶紫染色×200）；3B为划痕实验（×100）图6 FOXK1过表达逆转了miR-646过表达对U251细胞增殖和转移的作用：6A为细胞克隆形成实验（结晶紫染色×10）；6B为Transwell小室实验（结晶紫染色×200）；6C为划痕实验（×100）