妇科九味洗剂高效液相色谱法特征指纹图谱及成分定量研究

徐斌，梁朝锋，韩晓珂

妇科九味洗剂（批准文号为皖药制字Z20050018）是由芜湖市中医医院妇科专家根据多年临床经验，联合本制剂中心制成的以清热解毒、杀虫灭菌为主要功效的纯中药制剂，其主要提取工艺为加水提取两次，合并浓缩而成，用于治疗细菌性、霉菌性、滴虫性阴道炎及宫颈炎等症，疗效确切，作用显著，在我院妇科应用广泛，作为我院产业化明星产品之一，带来了显著的社会效益和经济效益。药理研究表明，方中白鲜皮、蒲公英、紫花地丁、野菊花均具有清热解毒等功效［1-4］，而苦参、蛇床子、百部、地肤子、土荆皮均具有抗菌杀虫等功效［5-9］。

目前本制剂的质量标准仅采用薄层色谱法对苦参和蛇床子进行定性鉴别，已无法适用现代中药对质量控制的需求。而中药指纹图谱着眼于中药的物质基础，能够全面地反映制剂包含的化学信息，有效地控制产品质量［10-12］。本研究于2020年5—8月，首次建立了妇科九味洗剂的HPLC特征图谱，并对其中咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷的含量进行定量研究，通过相似度评价，为全面评价本制剂的质量提供了依据。

1 仪器与材料

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，包括2695四元泵，2489紫外检测器，美国Waters公司；XP205型电子天平，Mettler Toledo公司。

材料：13批妇科九味洗剂样品由本院制剂室生产，批号为200610（S1）、200606（S2）、200531（S3）、200112（S4）、191117（S5）、191022（S6）、191008（S7）、191002（S8）、190907（S9）、190905（S10）、190804（S11）、190803（S12）、190612（S13）。相关饮片信息见表1。木犀草苷（批号111720-201609），咖啡酸（批号110885-200102），蒙花苷（批号111528-201308），以上对照品均购于中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱安捷伦Zorbax-SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇为流动相A，0.4%甲酸为流动相B，波长334 nm，进样量5 μL，柱温30℃［13］。按下表2进行梯度洗脱。

表2 梯度洗脱程序表

2.2 供试品溶液的制备精密量取样品（S1-S13）2 mL，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇至刻度，摇匀，过微孔滤膜（0.45 μm），取续滤液，即可。

2.3 指纹图谱研究结果

2.3.1 精密度试验取样品（S1）供试液，按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，连续进样测定6次，以7号色谱峰为参照，计算16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间RSD均≤0.11%，相对峰面积的RSD均≤2.98%，表示精密度良好，符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。

2.3.2 稳定性试验取样品（S1）供试液，按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，分别在0、2、4、6、8、10、12 h时间下进样，以7号色谱峰为参照，计算其余各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间RSD均≤0.09%，相对峰面积的RSD均≤2.99%，说明样品溶液在12 h内保持稳定。符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。

2.3.3 重复性试验取样品（S1）6份供试液，按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，以7号色谱峰为参照，计算其余各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间RSD均≤2.88%，相对峰面积的RSD均≤3.10%，重复性良好。符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。

2.3.4 特征指纹图谱结果与分析取上述13批妇科九味洗剂供试液，按照“2.1”色谱条件进样测定。打开“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），将得到的各批样品色谱图数据输入后进行数据匹配，设置S1为参照图谱，运用中位数法，时间宽度为0.1，经过多点校正、自动匹配后生成对照指纹图谱（R）和13批制剂样品的叠加指纹图谱，得到16个共有峰。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）进行分析，计算13批制剂样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。

13批制剂样品号：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13的相似度分别为0.967、0.975、0.962、0.945、0.912、0.991、0.981、0.994、0.989、0.992、0.998、0.977、0.945；均值为0.971±0.025。相似度评价结果显示，13批制剂与对照图谱相似度均＞0.91，相似度良好［14-16］。

通过与对照品色谱图比对，指认出3个成分，分别为5号峰咖啡酸，9号峰木犀草苷，13号峰蒙花苷。13批样品特征指纹图谱见图1。

图1 妇科九味洗剂13批样品HPLC特征指纹图谱

2.4 3种成分的含量测定

2.4.1 线性关系考察精密称取咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷对照品各14.55、11.80、12.55 mg，加甲醇制成浓度分别为58.2、47.2、62.75 mg∕L的对照品母液，分别从各个母液中精密量取5、10、16 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得各浓度分别为5.82、9.44、20.08 mg∕L的混合对照品溶液。在“2.1”色谱条件下分别进样1、2、4、6、8、10 μL，以进样量和峰面积作为横坐标（X）和纵坐标（Y），进行线性回归，见表3。

表3 妇科九味洗剂各成分定量的线性关系试验结果

2.4.2 精密度试验取样品（S1）供试品溶液，注入液相色谱仪，进样量5 μL，连续测定6次，得到咖啡酸峰面积（RSD=0.90%）、木犀草苷峰面积（RSD=2.06%）、蒙花苷峰面积（RSD=0.98%），表示精密度良好。

2.4.3 稳定性试验取样品（S1）供试品溶液，注入液相色谱仪，进样量5 μL，分别在0、2、4、6、12、24 h时间下进样分析，测得咖啡酸峰面积（RSD=1.41%）、木犀草苷峰面积（RSD=0.80%）、蒙花苷峰面积（RSD=0.70%），符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。提示在24 h内，供试品溶液稳定。

2.4.4 重复性试验取上述样品供试品6份，注入液相色谱仪，进样量5 μL，测得咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷的平均含量和RSD分别为0.164 6 g∕L（RSD=1.79%）、0.132 3 g∕L（RSD=2.07%）、0.340 5 g∕L（RSD=1.59%），表明重复性良好。符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。

2.4.5 加样回收率试验精密量取S1供试品溶液1 mL，共6份，置50 mL量瓶中，分别精密加入咖啡酸（58.2 mg∕L）3.3 mL、木犀草苷（47.2 mg∕L）2.8 mL、蒙花苷（62.75 mg∕L）5.5 mL，加入稀乙醇至刻度，摇匀，过微孔滤膜（0.45 μm），取续滤液，即可。将得到的供试液注入液相色谱仪，进样量5 μL。结果各个成分平均加样回收率分别为100.8%、98.1%、100.4%，RSD分别为1.16%、1.81%、1.06%。符合2020年中国药典四部附录（通则9101）关于液相色谱测定有关规定。

2.4.6 含量测定取13批妇科九味洗剂（S1-S13）各2 mL，按照“2.2”方法进行处理后，依据“2.1”色谱条件进行测定，混合对照品及样品色谱图见图2，表4。

图2 妇科九味洗剂样品及混合对照品HPLC色谱图：A为样品；B为混合对照品

表4 妇科九味洗剂13批样品中3种成分含量测定结果∕（g∕L）

3 讨论

3.1 流动相及波长的确定研究考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.4%甲酸、乙腈-0.2%甲酸系统对特征图谱的分离情况，通过分析各个系统对整个色谱峰的分离效果及特征峰信息量，最终确定甲醇-0.4%甲酸作为流动相。通过全波长扫描，重点对波长230、250、270、300、334、350 nm下的特征指纹图谱进行了考察，发现在334 nm下，特征图谱的信息量较大，特征峰的响应值较高，基线平稳度较好。

3.2 共有峰的确认及来源妇科九味洗剂HPLC特征指纹图谱共标定出共有峰16个，通过对照品比对，识别出咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷成分，查阅相关文献可知，蒙花苷为野菊花特有成分，咖啡酸和木犀草苷在野菊花和蒲公英中均存在［17-19］。

3.3 批间差异性分析13批样品生产中部分饮片来自于不同批次，故3个成分的含量存在一定的差异，但13批样品相似度均＞0.91，说明批间差异性较小，各个批次相似度较好，表明该生产工艺具有较好的稳定性和较高的成分保留率。

本研究首次建立了妇科九味洗剂HPLC特征指纹图谱及咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷三种成分含量测定，方法简便快捷，实用性强，为有效地控制本制剂的质量提供了科学的方法。后续研究将建立更多的成分测定，以期能更全方位控制制剂的质量。