千金藤素调控肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的实验研究

杨晓玲，赖丽金，谭桂兰

肝癌是一种严重威胁人类生命健康和影响人类生活质量的恶性肿瘤，其发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，目前肝癌的发生机制还未完全阐明［1］。手术切除、放射治疗和化疗等是常见的肝癌治疗手段，这些治疗方法取得了显著成果，但仍然不能满足需求［2］。千金藤素是从传统中药千金藤中提取出来的活性成分，具有抗炎、提高免疫力等功效［3］。很多研究显示，千金藤素还具有抗肿瘤作用，对于肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，并且可以在体外诱导细胞凋亡发生［4］。子宫内膜癌细胞经过千金藤素处理以后，细胞凋亡增多，细胞增殖能力下降［5］。在研究千金藤素对结肠癌生长影响的研究中发现，千金藤素可以有效下调肿瘤中核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路的激活程度［6］。NFκB是在肿瘤组织中异常激活的信号通路，抑制其激活可以阻碍肿瘤进展［7］。目前对于千金藤素对肝癌细胞增殖凋亡的影响和机制还不清楚。本研究于2020年1—6月，以肝癌细胞HepG2作为实验对象，探讨千金藤素处理后肝癌细胞增殖和凋亡变化，以期为千金藤素治疗肝癌提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、p21抗体购自美国Proteintech Group公司；千金藤素（BP0334）购自上海纪宁生物科研有限公司；活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）抗体购自美国Abcam；细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体、核因子κB p65（NF-κB p65）抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；NF-κB信号激活剂肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购自美国Sigma；肝癌细胞HepG2购自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 MTT方法检测细胞增殖活性取对数期的肝癌细胞，将细胞种植于96孔板，接种的细胞悬浮液浓度为3×103个细胞∕100 μL，将细胞放在培养箱中过夜培养，然后把上清吸弃，将细胞分成对照组和CEP组（5、10、20、40、80 μmol∕L共5个浓度梯度），对照组细胞用不添加千金藤素的培养液培养，CEP组细胞中添加5、10、20、40、80 μmol∕L千金藤素培养液。在培养箱中培养2 d以后，分别在每个孔内添加MTT各15 μL（浓度为5 g∕L），放在37℃培养箱内继续培养4 h，用移液枪小心吸尽孔内的上清，继续添加150 μL的DMSO溶液，震荡孵育结合10 min，在酶标仪上分别测定每个孔的A值，检测波长设置为490 nm。

1.3 PI单染检测细胞周期将对照组和CEP组细胞按照常规方法培养2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，添加冰预冷的乙醇（浓度为75%）溶液固定后，添加PI染液孵育结合20 min。放在流式细胞仪中测定细胞周期变化。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡将对照组和CEP组细胞按照常规方法培养2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，用PBS溶液将细胞洗涤2次，然后添加PI以及Annexin V-FITC染色液混合，加入300 μL的结合缓冲液，在使用流式细胞仪检测之前添加200 μL的结合缓冲液混合。

1.5 蛋白质印迹法检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白表达将对照组和CEP组细胞按照常规方法培养2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，在细胞沉淀中加入蛋白裂解试剂，置于冰水混合物上孵育20 min，转移到4℃离心机中，以12 000g高速离心10 min。移液枪把离心后的上清溶液转移到离心管中，使用二辛可宁酸（BCA）法检测蛋白浓度。在蛋白上清中添加5×上样缓冲液（loading buffer）均匀混合以后，放在沸水浴中孵育5 min，变性后的蛋白在-20℃保存。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制用10%分离胶以及5%浓缩胶。按照每个孔中50 μg蛋白上样，首先以90 V的电压在浓缩胶中电泳，等到溴酚蓝染料快要进入到浓缩胶以后，把电压调整到120 V继续电泳，溴酚蓝进入到底部以后停止电泳。取出凝胶，把NC膜裁剪成合适大小，在80 V电压条件下电转膜，转膜在冰上进行，转膜进行60 min。把NC膜放在封闭液（5%牛血清白蛋白溶液）中孵育2 h，然后将NC膜放在含有一抗的平皿内，在4℃过夜。NC膜置于含有二抗孵育液的平皿内，在37℃孵育2 h。ECL方法发光。内参设置为GAPDH，分析目的蛋白表达水平。cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65一抗稀释倍数为1∶600、1∶600、1∶600、1∶400、1∶600，二抗稀释倍数为1∶4 000。

1.6 NF-κB信号激活剂对千金藤素调控肝癌细胞增殖、周期和凋亡影响肝癌细胞用20 μg∕L NF-κB信号激活剂TNF-α和20 μmol∕L的千金藤素共同处理记为CEP+TNF-α组，按照MTT、PI单染和Annexin V-FITC∕PI双染法检测细胞增殖活性、周期和凋亡变化，蛋白质印迹法检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，步骤同上。

1.7 统计学方法用SPSS 21.0软件分析本研究数据，按照±s表示，两组数据间比较用t检验和Dunnett-t检验，多组差异比较用单因素方差，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 千金藤素对肝癌细胞增殖活性影响10、20、40、80 μmol∕L的千金藤素处理后的肝癌细胞增殖活性降低（表1）。20 μmol∕L的千金藤素对肝癌细胞增殖抑制率约为50%，选用20 μmol∕L的千金藤素做后续研究。

表1 千金藤素（CEP）处理后肝癌细胞吸光度（A值）变化

表1 千金藤素（CEP）处理后肝癌细胞吸光度（A值）变化

注：①与0 μmol∕L比，均P＜0.05。

组别对照组CEP 5 μmol∕L组CEP 10 μmol∕L组CEP 20 μmol∕L组CEP 40 μmol∕L组CEP 80 μmol∕L组F值P值重复次数3 3 3 3 3 3 A值0.68±0.05 0.63±0.06 0.50±0.03①0.36±0.03①0.28±0.02①0.21±0.01①77.20＜0.001

2.2 千金藤素对肝癌细胞周期和凋亡影响千金藤素处理后的肝癌细胞G0∕G1期细胞比例升高，细胞凋亡率升高，细胞中周期促进因子cyclin D1蛋白水平下降，周期抑制因子p21蛋白水平升高，凋亡促进蛋白Bax、cleaved-caspase-3水平升高（表2）。千金藤素阻滞肝癌细胞周期并诱导细胞凋亡。

表2 千金藤素处理后肝癌细胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

表2 千金藤素处理后肝癌细胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

注：CEP为千金藤素，cyclin D1为细胞周期蛋白D1，Bax为Bcl-2相关X蛋白，cleaved caspase-3为活化胱天蛋白酶3。

组别对照组CEP组t值P值重复次数3 3细胞周期比例∕%G0∕G1 50.61±4.17 65.81±3.73 4.71 0.009 S 18.35±1.16 10.54±1.09 8.50 0.001 G2∕M 31.04±2.81 23.65±1.50 4.02 0.016凋亡率∕%2.18±0.12 13.47±1.58 12.34＜0.001 cyclin D1 0.68±0.07 0.39±0.04 6.20 0.003 p21 0.20±0.03 0.41±0.05 6.18 0.003 Bax 0.32±0.03 0.66±0.06 8.71 0.001 cleaved caspase-3 0.15±0.02 0.31±0.04 6.10 0.004

2.3 千金藤素对肝癌细胞中NF-κB信号的影响千金藤素处理后的肝癌细胞中NF-κB关键蛋白NFκBp65水平［（0.19±0.02）比（0.36±0.05），t=5.41，P＜0.05］下降（图1）。千金藤素抑制肝癌细胞中NF-κB信号激活。

图1 蛋白质印迹法检测千金藤素对肝癌细胞中NF-κBp65蛋白表达影响

2.4 NF-κB信号激活剂对千金藤素影响肝癌细胞增殖活性、周期和凋亡的作用与单纯经过千金藤素处理的细胞比较，NF-κB信号激活剂TNF-α和千金藤素共同处理后的肝癌细胞增殖活性升高，G0∕G1期比例降低，凋亡率降低（图2，表3）。NF-κB信号激活剂逆转千金藤素对肝癌细胞增殖抑制、周期阻滞和凋亡促进作用。

表3 NF-κB信号激活剂和千金藤素（CEP）处理后肝癌细胞A值、细胞周期分布比例和凋亡率

表3 NF-κB信号激活剂和千金藤素（CEP）处理后肝癌细胞A值、细胞周期分布比例和凋亡率

注：CEP为千金藤素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。

组别CEP CEP+TNF-α t值P值重复次数3 3 A值0.35±0.04 0.46±0.03 3.76 0.020细胞周期比例∕%G0∕G1 66.38±5.80 53.27±4.12 3.19 0.033 S 11.94±1.21 22.65±1.27 10.58 0.001 G2∕M 21.68±2.37 22.08±2.15 0.22 0.837凋亡率∕%14.17±1.28 8.12±0.96 6.55 0.003

图2 流式细胞术检测NF-κB信号激活剂和千金藤素处理后肝癌细胞凋亡变化

2.5 NF-κB信号激活剂对千金藤素影响肝癌细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NFκBp65蛋白表达作用与单纯经过千金藤素处理的细胞比较，NF-κB信号激活剂TNF-α和千金藤素共同处理后的肝癌细胞中cyclin D1蛋白水平升高，p21、Bax、cleaved-caspase-3蛋 白 水 平 降 低，NF-κBp65蛋白水平升高（图3，表4）。NF-κB信号激活剂逆转千金藤素对肝癌细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白表达影响。

表4 NF-κB信号激活剂和千金藤素处理后肝癌细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

表4 NF-κB信号激活剂和千金藤素处理后肝癌细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

注：CEP为千金藤素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，cyclin D1为细胞周期蛋白D1，Bax为Bcl-2相关X蛋白，cleaved caspase-3为活化胱天蛋白酶3，NF-κB p65为核因子κB p65。

组别CEP CEP+TNF-α t值P值重复次数3 3 cyclin D1 0.36±0.03 0.54±0.06 4.72 0.009 p21 0.43±0.05 0.20±0.02 7.31 0.002 Bax 0.59±0.07 0.39±0.04 4.28 0.013 cleaved-caspase-3 0.34±0.03 0.18±0.02 7.50 0.002 NF-κBp65 0.35±0.05 0.52±0.04 4.56 0.010

图3 蛋白质印迹法检测NF-κB信号激活剂和千金藤素处理后肝癌细胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平

3 讨论

本研究表明，千金藤素处理后的肝癌细胞增殖能力下降，千金藤素具有抑制肝癌细胞生长的作用。千金藤素是一种双亲性、带有正电荷的生物碱，能够增加质膜的稳定性，提高机体免疫力、抑制炎症发生［8］。千金藤素还具有抗肿瘤生长的作用，单独使用千金藤素能够抑制肿瘤细胞的生长并提高机体免疫力［9］。研究显示，千金藤素可以在体外抑制口腔鳞癌、结肠癌等肿瘤细胞增殖［10-11］。本研究结果与上述研究报道相符合，均提示千金藤素具有体外抗肿瘤细胞生长的作用。

研究表明，千金藤素抑制肿瘤细胞生长与影响细胞周期进程有关［12］。细胞周期进展是细胞增殖的关键，细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束称为一个细胞周期，在这一过程中，细胞周期调控因子扮演重要角色［13］。cyclin D1是细胞周期的正调控因子，其可以促进细胞从G0∕G1期向S期转变［14］。p21是细胞周期的负调控因子，其表达水平升高后可以抑制肿瘤细胞有序进展［15］。细胞凋亡减少是肿瘤发生的重要特征，细胞凋亡与细胞内凋亡相关蛋白的表达有关，其中Bcl-2和caspase蛋白家族是目前研究最多的与细胞凋亡有关的调节因子［16］。Bax是Bcl-2蛋白家族成员，其在细胞凋亡过程中发挥促进作用［17］。caspase-3是caspase凋亡级联反应的下游执行因子，其活化后形成cleavedcaspase-3被认为是细胞凋亡发生的标志［18］。本研究显示，千金藤素处理后的肝癌细胞G0∕G1期比例升高，细胞中cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，细胞凋亡率升高，细胞中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达增多，提示千金藤素可以抑制肝癌细胞周期进展并诱导细胞凋亡发生。

NF-κB是在B细胞中发现的一种核因子，其常常以二聚体的形式在细胞内存在，NF-κB在多种类型的细胞中均有表达，并且参与细胞多种病理和生理过程［19］。NF-κBp65是NF-κB信号转导的必需因子，也是NF-κB信号激活程度的标志［20］。NF-κB与人类肿瘤进展有关，其在肿瘤发生中过度激活，通过靶向抑制NF-κB的激活可以降低肿瘤的恶性程度［21］。本研究显示，千金藤素处理以后的肝癌细胞中NF-κB信号激活程度降低，提示千金藤素可能通过抑制NF-κB信号通路调控肝癌细胞增殖和凋亡。之前的研究报道表明，千金藤素在抵抗结直肠癌等肿瘤细胞恶性生长的同时可以下调细胞内NF-κB信号通路的激活水平，千金藤素作用机制与NF-κB信号有关［6］。本研究表明，NF-κB信号激活剂可以逆转千金藤素对肝癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用，提示千金藤素通过抑制NF-κB调控肝癌细胞增殖和凋亡。

以上表明，千金藤素具有体外抑制肝癌细胞增殖、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡的作用，其作用机制与抑制NF-κB信号有关。本研究结果为研究千金藤素抗肿瘤作用机制提供了参考，为千金藤素治疗肝癌的临床应用提供了理论资料。在以后的实验中会对千金藤素的具体作用机制进行探讨和验证。