黄芪通过微小RNA-133a抑制Janus激酶/信号转导和转录激活因子信号通路抑制膀胱癌的迁移和侵袭

祝仰廷，李刚，孙伟，刘丙峰，贾浩，江山，厉昌杰

膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤，其复发率和死亡率高，且易发生转移［1］。研究表明中医药在治疗膀胱癌中具有增效减毒作用［2］。因此，寻找可以抑制膀胱癌细胞转移的中药及其作用的分子机制对膀胱癌的治疗具有重要意义。黄芪是豆科植物膜荚黄芪的干燥根，主要成分为黄芪多糖、皂苷、黄酮等，具有抗肿瘤作用［3］。研究报道黄芪可抑制喉癌细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡［4］。黄芪多糖增强了阿帕替尼对胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用［5］。然而黄芪对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制尚不清楚。研究表明miRNA参与调控肿瘤的发生发展过程，与膀胱癌的发生发展也密切相关［6］。研究报道miR-133a在膀胱癌病人中低表达，其表达水平可作为膀胱癌非侵入性诊断标志物，及膀胱癌治疗的新靶点［7］。而黄芪多糖通过上调miR-133a可减少人骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［8］。此外有研究报道miR-153可通过抑制Janus激酶∕信号转导和转录激活因子（Janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信号通路抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力［9］。因此，本研究于2019年8月至2020年2月进行，旨在研究黄芪对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响以及其机制是否与miR-133a和JAK∕STAT信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 材料T24细胞购自美国模式培养物研究所（ATCC）；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；黄芪购自北京凯瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒购自碧云天生物技术研究所；抗体购自上海信裕生物技术有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国Bio-Rad公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；JAK∕STAT信号通路特异性阻滞剂AG490购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2 细胞培养T24细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5%二氧化碳条件下培养，2 d换液一次，待细胞融合至80%左右时，进行消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞处理与分组取对数生长期T24细胞，用浓度分别为40 mg∕L、80 mg∕L、160 mg∕L的黄芪处理T24细胞，作为不同浓度黄芪组；正常培养的细胞作为对照（NC）组，后续实验中采用160 mg∕L的黄芪处理记为黄芪组。将miR-133a模拟物（mimic）阴性对照（miR-NC）、miR-133a mimic（miR-133a）、miR-133a抑制剂（inhibitor）阴性对照（anti-miR-NC）、miR-133a inhibitor（anti-miR-133a）分别转染至T24细胞中，记为miR-NC组、miR-133a组、anti-miR-NC组、anti-miR-133a组；将anti-miR-NC、anti-miR-133a分别转染至T24细胞中再用浓度为160 mg∕L的黄芪处理，记为黄芪+anti-miR-NC组、黄芪+anti-miR-133a组；将anti-miR-133a转染至T24细胞后再分别用浓度为160 mg∕L的黄芪和10 μmol AG490处理，记为黄芪+anti-miR-133a+AG490组。转染均按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.4 蛋白质印迹法（Western blotting）检测基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-2，MMP-9）、磷酸化Janus激酶1（p-JAK1）、磷酸化信号转导和转录激活因子6（p-STAT6）蛋白表达各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再分别加入一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2 000）室温孵育90 min，TBST洗涤，用ECL发光液显影，用ChemiDoc XRS+系统成像，用Quantity One凝胶分析软件测定各组蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值∕β-actin条带灰度值。

1.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭细胞迁移实验：分别将500 μL RPMI-1640完全培养液和200 μL细胞悬液加入Transwell小室的下室和上室，然后于恒温培养箱孵育24 h。取出小室，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并拍照，计算结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：将60 μL Matrigel加入300 μL无血清的RPMI-1640培养液中混匀，然后取100 μL平铺于Transwell小室的上室，凝固后按迁移实验操作进行。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-133a表达水平各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，进行PCR扩增，循环条件为95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR-133a以U6为内参，miR-133a：正向引物序列5'-TAACAGTCTACAGCCA-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6：正向引物序列5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，总体有差异进一步采用LSD-t检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响与对照组相比，不同浓度黄芪组MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平降低，细胞迁移和侵袭数量降低（P＜0.05），见图1，表1。

表1 不同浓度黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响s

表1 不同浓度黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响s

注：MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。①与对照组比较，P＜0.05。

组别对照组40 mg∕L黄芪组80 mg∕L黄芪组160 mg∕L黄芪组F值P值重复次数3 3 3 3 MMP-2蛋白相对表达量0.88±0.07 0.72±0.07①0.55±0.04①0.36±0.03①48.74＜0.001 MMP-9蛋白相对表达量0.95±0.08 0.79±0.06①0.60±0.05①0.40±0.04①48.14＜0.001细胞迁移数175.43±16.02 141.23±13.27①107.46±10.14①81.42±8.05①33.35＜0.001细胞侵袭数142.55±14.03 122.24±10.25①89.38±7.45①71.23±8.01①29.27＜0.001

图1 蛋白质印迹法检测黄芪处理的T24细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达

2.2 黄芪对T24细胞中miR-133a表达水平和JAK/STAT信号通路的影响（160 mg/L黄芪）与对照组相比，黄芪组miR-133a相对表达水平升高，p-JAK1、p-STAT6蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），见图2，表2。

表2 黄芪对T24细胞中miR-133a表达水平和JAK∕STAT信号通路的影响s

表2 黄芪对T24细胞中miR-133a表达水平和JAK∕STAT信号通路的影响s

注：miR-133a为微小RNA-133a，p-JAK1为磷酸化Janus激酶1，p-STAT6为磷酸化信号转导和转录激活因子6。

组别对照组黄芪组t值P值重复次数3 3 miR-133a相对表达量1.00±0.11 2.36±0.21 5.74＜0.001 p-JAK1蛋白相对表达量0.55±0.04 0.12±0.01 10.43＜0.001 p-STAT6蛋白相对表达量0.38±0.03 0.08±0.01 9.49＜0.001

图2 蛋白质印迹法检测黄芪处理的T24细胞p-JAK1、p-STAT6蛋白的表达

2.3 miR-133a对T24细胞迁移和侵袭的影响与miR-NC组相比，miR-133a组miR-133a相对表达水平升高，MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平降低，细胞迁移和侵袭数量降低（P＜0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-133a组miR-133a相对表达水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平升高，细胞迁移和侵袭数量升高（P＜0.05），见图3，表3。

表3 miR-133a对T24细胞迁移和侵袭的影响

表3 miR-133a对T24细胞迁移和侵袭的影响

注：MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。①与miR-NC比较，P＜0.05。②与anti-miR-NC比较，P＜0.05。

组别miR-NC miR-133a anti-miR-NC anti-miR-133a F值P值重复次数3 3 3 3 miR-133a相对表达量1.00±0.11 2.73±0.25①1.02±0.13 0.46±0.04②125.41＜0.001 MMP-2蛋白相对表达量0.86±0.07 0.45±0.04①0.84±0.08 1.07±0.09②38.19＜0.001 MMP-9蛋白相对表达量0.94±0.08 0.52±0.05①0.97±0.10 1.22±0.11②32.60＜0.001细胞迁移数171.16±15.04 105.11±9.86①176.89±16.37 218.03±20.09②26.32＜0.001细胞侵袭数139.04±12.37 107.35±9.67①134.12±12.67 159.31±14.94②8.71＜0.001

图3 蛋白质印迹法检测miR-133a转染处理的T24细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达

2.4 anti-miR-133a可以逆转黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响与黄芪+anti-miR-NC组相比，与黄芪+anti-miR-133a组miR-133a相对表达水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平升高，细胞迁移和侵袭数量升高（P＜0.05），见图4，5；表4。

表4 anti-miR-133a可以逆转黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响∕

表4 anti-miR-133a可以逆转黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响∕

注：MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。

组别黄芪+anti-miR-NC黄芪+anti-miR-133a t值P值重复次数3 3 miR-133a相对表达量1.00±0.11 0.48±0.03 4.56＜0.001 MMP-2蛋白相对表达量0.34±0.03 0.80±0.06 6.86＜0.001 MMP-9蛋白相对表达量0.42±0.04 0.86±0.08 4.92＜0.001细胞迁移数84.67±8.31 167.04±15.46 4.69＜0.001细胞侵袭数76.39±7.14 128.49±11.66 3.81＜0.001

2.5 AG490可以逆转anti-miR-133a联合黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响与黄芪+anti-miR-133a组 相 比，黄 芪+anti-miR-133a+AG490组p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平降低，细胞迁移和侵袭数量降低（P＜0.05），见图6，7；表5。

表5 AG490可以逆转anti-miR-133a联合黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响

表5 AG490可以逆转anti-miR-133a联合黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响

注：p-JAK1为磷酸化Janus激酶1，p-STAT6为磷酸化信号转导和转录激活因子6，MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。

组别黄芪+anti-miR-133a黄芪+anti-miR-133a+AG490 t值P值重复次数3 3 p-JAK1蛋白相对表达量0.50±0.04 0.26±0.02 5.37＜0.001 p-STAT6蛋白相对表达量0.32±0.03 0.12±0.01 6.33＜0.001 MMP-2蛋白相对表达量0.80±0.06 0.38±0.03 6.26＜0.001 MMP-9蛋白相对表达量0.88±0.08 0.48±0.05 4.24＜0.001细胞迁移数量162.01±15.24 96.83±9.02 3.68＜0.001细胞侵袭数量123.57±10.02 90.55±8.76 2.48＜0.001

3 讨论

肿瘤转移是临床治疗失败的主要原因，寻找抗侵袭、抗转移的药物是提高肿瘤治疗成功的关键，而中医药在抗肿瘤方面具有独特的优势，积极探讨中医药预防肿瘤的侵袭和转移机制，努力开发中药资源具有重要意义［10-11］。研究表明黄芪具有抗肿瘤功效［12］。如黄芪注射液可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移，并促进细胞凋亡［13］。黄芪多糖可抑制卵巢癌细胞的生长［14］。黄芪多糖抑制非小细胞肺癌细胞H1299的迁移和侵袭［15］。以上研究结果表明黄芪及其有效成分可通过调控miRNA或信号通路抑制肿瘤的生长和转移。然而黄芪对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响尚不清楚，为研究黄芪对膀胱癌细胞的有影响，本研究用不同浓度的黄芪处理膀胱癌细胞T24，结果显示，黄芪处理的膀胱癌细胞T24中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低，细胞迁移和侵袭数量降低，说明黄芪可抑制膀胱癌细胞T24迁移和侵袭。

图5 蛋白质印迹法检测anti-miR-133a处理的T24细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达

图7 蛋白质印迹法检测AG490处理的T24细胞p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白的表达

此外，本研究还发现黄芪处理的膀胱癌细胞T24中miR-133a表达水平升高，说明黄芪可以上调miR-133a的表达，与文献［9］研究结果相符。且有研究表明miR-133a在膀胱癌中下调表达［16］。lncRNA XIST通过靶向下调miR-133a可促进膀胱癌细胞的增殖和迁移［17］。为研究黄芪对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭影响的机制是否与miR-133a有关，本研究检测了黄芪处理的膀胱癌细胞T24中miR-133a表达水平，结果显示，黄芪可以上调miR-133a的表达。本研究还证实了过表达miR-133a可抑制膀胱癌细胞T24迁移和侵袭；而抑制miR-133a表达可促进膀胱癌细胞T24迁移和侵袭。与前人研究结果相符。为进一步研究黄芪是否通过影响miR-133a表达影响膀胱癌细胞，本研究抑制miR-133a表达的同时用黄芪处理T24细胞，结果显示，抑制miR-133a表达逆转了黄芪对T24细胞迁移和侵袭的抑制作用。提示，黄芪可能通过调控miR-133a的表达影响膀胱癌细胞T24迁移和侵袭。

JAK∕STAT信号通路参与多种实体肿瘤的发生及转移［18］。研究报道激活JAK2∕STAT3途径可诱导膀胱癌细胞的迁移和侵袭［19］。黄芪多糖通过抑制JAK∕STAT3信号通路可抑制口腔鳞癌细胞SCC-25裸鼠移植瘤的生长［20］。为研究黄芪是否通过JAK∕STAT3信号通路影响膀胱癌细胞的迁移和侵袭，本研究检测了黄芪处理的膀胱癌细胞T24中JAK∕STAT3信号通路相关蛋白的表达，结果显示，p-JAK1、p-STAT6蛋白相对表达水平降低，表明黄芪可能抑制JAK1∕STAT6信号通路激活。且本研究还发现抑制miR-133a表达逆转了黄芪对JAK1∕STAT6信号通路的抑制作用。表明黄芪可能通过miR-133a影响JAK∕STAT信号通路，为进一步研究JAK∕STAT信号通路与黄芪及miR-133a的关系，本研究用JAK-STAT3信号通路的阻滞剂AG490处理抑制miR-133a表达联合黄芪作用的T24细胞，结果显示，p-JAK1、p-STAT6、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低，细胞迁移和侵袭数量降低；说明阻滞JAK∕STAT信号通路可以逆转抑制miR-133a表达联合黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响。

综上所述，黄芪可能通过上调miR-133a表达抑制JAK∕STAT信号通路抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。为临床治疗膀胱癌提供了参考及可能的分子作用靶点。

（本文图4，6见插图1-3）

图4 anti-miR-133a逆转黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色×200） 图6 AG490逆转anti-miR-133a联合黄芪对T24细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色×200）