湿热处理环境下咖啡酸/绿原酸对板栗淀粉消化和回生性能的影响

陈瑾 何大伟 陈玲

（华南理工大学食品科学与工程学院/广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室/淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心，广东 广州 510640）

我国是板栗的原产地，产量常年居世界第一。板栗具有丰富的营养功能和保健价值，日常生活中可以被蒸煮食用，也可以被加工成各种各样的板栗产品，如糖炒板栗、板栗果脯、板栗罐头等，深受消费者的喜爱。但是这些加工后的板栗容易消化吸收，被人体摄入后在短时间内会产生较高的血糖指数，血糖含量波动较大［1］，长期食用容易增加糖尿病、肥胖症等慢性代谢疾病的发病率。此外，板栗储藏加工过程中存在板栗淀粉易回生、板栗产品货架期短等问题［2］，制约了现代板栗食品加工业的发展。

淀粉是板栗的主要成分，约占板栗干基的38%～80%［2］，是影响板栗营养功能和食品品质的关键因素。特定的物理加工过程能够调控淀粉的多尺度结构，从而影响淀粉类食品的营养功能和加工品质，其中湿热处理加工技术因其加工过程中只涉及水和热的作用，操作简单、绿色安全且环保，在食品加工领域备受青睐［3］。大量研究表明，湿热处理可以在破坏淀粉内部原有氢键结构的同时促进形成新的螺旋及致密的有序化结构，从而有效降低淀粉的酶解程度，提高其营养功能［4］。但湿热处理会造成淀粉分子链的断裂，形成较多的短直链淀粉，促进淀粉的回生［5］。此外，由于多酚具有抗氧化、降低血脂、调节血糖等优良生理活性功能［6］，利用淀粉与多酚复合作用来调节淀粉的营养功能和食品加工品质是目前食物营养健康和淀粉科学领域的研究热点。多酚化合物可以干扰淀粉分子链的回生重结晶行为，抑制淀粉的回生［7］，但是目前对于湿热处理协同多酚复合改性淀粉来抑制淀粉消化性能、改善淀粉抗回生性能的研究相对较少。利用湿热处理协同多酚复合诱导板栗淀粉特定结构域的改变，继而调控其消化和回生性能，有助于创制满足当前营养健康需求的板栗制品，并延长产品货架期。

淀粉-多酚复合物结构及消化、回生性能的差异与多酚分子的结构密切相关，但目前鲜见有关多酚结构对多酚化合物协同调控淀粉消化及回生性能影响的报道。此外，在食品加工应用中，常常需要对改性淀粉颗粒进行储藏，储藏回生过程会促使淀粉的颗粒结构发生变化，继而影响其营养和加工性能。有鉴于此，文中选取不同结构特征的咖啡酸（Caffeic Acid，CCA）和绿原酸（Chlorogenic Acid，CGA）多酚化合物为添加物，利用湿热处理技术制备板栗淀粉-多酚复合物，考察多酚化合物结构对淀粉-多酚复合物多尺度结构、消化性能及回生性能的影响机制，以期为构建品质优良、营养健康的板栗淀粉基食品提供理论参考和基础数据。

1 实验

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

油臻板栗：福建白岩农业科技示范场出产；绿原酸（纯度99%）：陕西森弗天然制品有限公司产品；咖啡酸（纯度99%）：陕西森弗天然制品有限公司产品；猪胰α-淀粉酶（P-7545）：美国Sigma公司产品；淀粉葡萄糖苷酶（A-3360）：美国Sigma公司产品；GOPOD试剂盒（K-GLUC）：爱尔兰Megazyme公司产品；其他化学试剂均为分析纯级别。

1.1.2 主要仪器设备

PE987型湿热处理系统：深圳信宜特公司产品；UV-3802型紫外可见分光光度计：美国UNICO公司产品；4000型差示扫描量热仪（DSC）：美国Perkin Elmer公司产品；SAXSess小角X射线散射仪：奥地利Anton Parr公司产品；X’pert PRO X射线衍射仪：荷兰Panalytial公司产品；iS50 FT-IR Nicolet傅里叶转换红外光谱仪：美国Thermo Fisher公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 板栗淀粉的提取

将板栗脱壳粉碎打浆后加入质量分数为0.45%的焦亚硫酸钠溶液，在4℃下静置48 h后过滤板栗浆液，留取沉淀物。向板栗沉淀物中加入去离子水稀释并过滤去除残渣，重复清洗3次后留取滤液备用。将滤液在4 000 r/min的条件下离心10 min后，用去离子水和无水乙醇分别洗涤离心沉淀物3次，得到板栗湿淀粉。将湿淀粉放在40℃烘箱中干燥24 h，粉碎过80目筛留存备用。按照GB 5009.9—2016［8］中的酶水解法测得板栗淀粉的纯度为97.4%±0.9%，肉眼观测提取的板栗淀粉色泽纯白、无异味，所获得的板栗淀粉纯度较高。板栗淀粉的水分含量为11.97%±1.53%，直链淀粉含量为29.0%±0.6%。

1.2.2 湿热处理制备板栗淀粉-多酚复合物

称取20 g板栗淀粉，将咖啡酸和绿原酸按4%（质量分数，以淀粉干基为基准）的比例加入板栗淀粉中，充分混匀。随后将板栗淀粉和多酚混合物的水分含量调至20%，并在105℃下处理2h制备湿热处理板栗淀粉及其多酚复合物。一部分样品直接冷冻干燥，另一部分样品置于4℃下储藏7d后冷冻干燥，所有样品粉碎过80目筛备用。根据咖啡酸/绿原酸的结构将湿热处理制备的板栗淀粉-咖啡酸复合物和板栗淀粉-绿原酸复合物分别标记为HMTCCA-0 d和HMT-CGA-0 d，回生7 d的板栗淀粉-咖啡酸复合物和板栗淀粉-绿原酸复合物分别标记为HMT-CCA-7 d和HMT-CGA-7 d。未经处理的板栗淀粉以及做相同湿热处理但未添加多酚化合物的板栗淀粉分别标记为CST和HMT-CST。

1.2.3消化性能测定

回生前后湿热处理板栗淀粉及其多酚复合物的体外消化性能的测定参考Englyst法并加以改进［9］。由于多酚化合物的存在，以快消化成分（Rapidly Digestible Ingredient，RDI）、慢消化成分（Slowly Digestible Ingredient，SDI）、抗消化成分（Resistant Ingredient，RI）以及抗酶解成分（Anti-Enzymatic Ingredient，AEI，由SDI+RI构成）含量来衡量湿热处理板栗淀粉及其咖啡酸/绿原酸复合物的消化性能。

1.2.4 回生性能测定

称取回生前后的淀粉样品4mg（干基）于DSC高压盘内，加去离子水使淀粉干基与水质量比为1∶2，密封后于室温下平衡24 h。DSC测试参数为：温度范围20～100℃，升温速率10℃/min。通过DSC曲线得到淀粉样品的起始糊化温度（To）、峰值温度（Tp）、终止温度（Tc）、糊化焓（ΔHg）以及回生焓（ΔHr），由此计算淀粉的回生率DR：

式中，ΔHgi为测试样品的糊化焓，ΔHri为测试样品的回生焓，ΔHg0为板栗淀粉的糊化焓。

1.2.5 表面短程有序结构分析

将适量淀粉样品置于傅里叶红外光谱仪（FTIR）的衰减全反射附件（ATR）上进行测试。测试参数为：扫描次数64次，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4cm-1，以空气为背景。采用OMNIC软件对样品的红外光谱进行去卷积，采用Lorenz curve函数，设置增强因子和半峰宽分别为1.9和19 cm-1，获得1045cm-1和1022cm-1处的峰强度，计算1045cm-1和1 022 cm-1处的峰强度比R1045/1022，用来代表淀粉的短程有序结构。

1.2.6 结晶结构分析

将事先平衡好水分的淀粉样品置于XRD衍射仪样品台中进行测试。测试参数设置为：单色Cu-Kα射线（波长0.154 2 nm），管流40 mA，管压40 kV，扫描结构10 s，扫描起始角3°，扫描终止角40°，步长0.016°。采用MDI Jade 6.0软件按照Frost等的方法［10］计算湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的相对结晶度C。

1.2.7 层状结构分析

将淀粉样品配制成质量分数为60%的淀粉乳进行测试。测试条件为：单色Cu-Kα射线（波长0.154 2nm），管压40kV，管流50mA；样品与影像板间距为261.2 mm，曝光时间5 min，测试温度25℃。利用SASX quant 3.0软件进行归一化和消模糊处理后得到散射图谱。

1.2.8 数据分析

采用Excel 2017软件建立数据库，通过SPSS 20.0软件进行统计分析。组间数据采用单因素方差进行分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。

表1 板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉和板栗淀粉-多酚复合物的RDI、SDI、RI以及AEI含量1）Table 1 RDI，SDI，RI and AEI contents of CST，HMT-CST and HMT-treated starch-polyphenol complexes before and after retrogradation

2 结果与讨论

2.1 湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的消化性能

表1为板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉和板栗淀粉-多酚复合物颗粒的RDI、SDI、RI和AEI含量。表中数据显示，与板栗淀粉相比，湿热处理后板栗淀粉的SDI含量显著降低，而RDI和RI含量增大。相较于湿热处理淀粉颗粒，咖啡酸/绿原酸的加入均可显著降低板栗淀粉的消化性能，致使淀粉-多酚复合物的RDI含量下降，而SDI和RI含量上升。这说明在湿热处理环境下，绿原酸/咖啡酸的添加可以促进淀粉分子链形成抗酶解有序结构，从而增强其抗消化性能。

此外，对于食品加工业来说，板栗制品是以熟制品的方式最终被消费者食用的，因此有必要进一步探究湿热处理协同多酚复合改性板栗淀粉糊的消化性能。与淀粉颗粒的消化性能不同，湿热处理板栗淀粉样品的RDI含量小于板栗淀粉。这是因为湿热处理会促进淀粉分子链间的重排，形成少量新的单螺旋、V型结晶结构［11］，这些有序化结构具有较强的抗热稳定性和抗酶解性，增强了板栗淀粉的抗消化性能。而绿原酸及咖啡酸的加入使得板栗淀粉的RDI含量进一步下降，SDI和RI含量进一步增加，并且咖啡酸的抗消化增强作用明显大于绿原酸。以上结果表明，湿热处理协同多酚复合作用可以显著增强板栗淀粉的抗消化性能，有利于创制营养健康的板栗制品。

由表1数据还可知，回生7d后湿热处理板栗淀粉及板栗淀粉-多酚复合物颗粒的RDI含量下降，SDI和RI含量增加，表明回生过程可以促进淀粉分子链自身重排及其与多酚的复合重组，进而形成致密有序结构，增强淀粉的抗消化性能。不同结构的多酚化合物对回生后板栗淀粉消化性能的调控效果不尽相同。相对于绿原酸，湿热处理板栗淀粉-咖啡酸复合物的抗消化性能更强，表明咖啡酸调控板栗淀粉颗粒的抗消化性能更为有效。

2.2 湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的回生性能

图1为板栗淀粉、4℃下放置7 d前后湿热处理板栗淀粉及其多酚复合物的差示扫描量热曲线，其相关相变焓如表2所示。相对于板栗淀粉，湿热处理后淀粉的ΔHg值显著下降，表明湿热处理会破坏板栗淀粉分子链间或分子内的原有氢键，致使板栗淀粉原有的结晶结构遭到破坏，糊化焓降低。咖啡酸/绿原酸的加入可进一步降低板栗淀粉的ΔHg值，并且淀粉-绿原酸多酚复合物的ΔHg值低于淀粉-咖啡酸多酚复合物。在湿热处理环境中，多酚化合物与板栗淀粉分子间的复合作用会促使板栗淀粉的结晶及双螺旋结构进一步破坏，致使其复合物的糊化焓下降。

图1 板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉和板栗淀粉-多酚复合物的差示扫描量热图Fig.1 DSC thermograms of CST，HMT-CST and HMT-treated starch-polyphenol complexes before and after retrogradation

表2 板栗淀粉、湿热处理板栗淀粉及湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的回生性能1）Table 2 Retrogradation property of CST，HMT-CST and HMTtreated starch-polyphenol complexes

相对于ΔHg值，回生7d后的湿热处理板栗淀粉及板栗淀粉-多酚复合物的ΔHr值均增加，证实了低温储藏过程中淀粉的回生现象。回生过程中淀粉分子链重组形成新的有序结晶结构，这些结构需要更多的热量来溶解，致使热焓增大。但是相对于淀粉糊溶液［5］，湿热处理体系的低水分含量（20%）会抑制淀粉分子链回生重排，致使淀粉的回生效应较低，热焓增量（ΔHr-ΔHg值）不大，总体回生现象不明显。通过对比回生率DR可以发现，在湿热处理环境中，绿原酸及咖啡酸多酚化合物的加入可以有效抑制板栗淀粉颗粒的回生过程，回生率下降，并且咖啡酸抑制的效果要强于绿原酸。以上结果显示，湿热处理环境中板栗淀粉与多酚化合物复合作用能有效抑制板栗淀粉颗粒的回生性能，并且不同结构的多酚化合物对板栗淀粉的回生性能具有显著的调控效果。

2.3 湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的表面短程有序结构

图2为板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉和板栗淀粉-多酚复合物颗粒的ATR-FTIR红外光谱图和去卷积图谱。可以看出，经湿热处理以及多酚复合改性后的淀粉红外光谱图中未出现新的特征吸收峰，表明湿热处理协同多酚复合作用并没有导致淀粉分子发生衍生化。

红外去卷积图谱1045cm-1处的特征峰与1022cm-1处的特征峰的强度变化可以表示淀粉表面短程有序结构的变化规律，并且两特征峰强度比R1045/1022越大，短程有序化程度越高。板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉和板栗淀粉-多酚复合物的表面短程有序度（即R1045/1022值）如表3所示。由表可知，相对于板栗颗粒，湿热处理后板栗淀粉的R1045/1022值增加，表明尽管湿热处理可以破坏板栗淀粉的结晶结构，但淀粉分子链在热能和水分的作用下可以重新排列和聚集形成局部有序聚集体，提高板栗淀粉的RI含量（见表1）。

相对于湿热处理板栗淀粉，板栗淀粉-多酚复合物的R1045/1022值进一步增大，并且板栗淀粉-咖啡酸复合物的颗粒表面有序度要高于板栗淀粉-绿原酸复合物。多酚化合物可以与淀粉通过疏水或氢键相互作用形成单螺旋或局部双螺旋结构［12］，增强淀粉颗粒的表面有序性，从而增强板栗淀粉的抗消化性能。咖啡酸/绿原酸对板栗淀粉多尺度结构的影响程度主要取决于两者自身结构的差异。咖啡酸分子中同时具有酚羟基和丙烯酸两种平面官能团结构（见图3），且分子体积较小，更易与淀粉分子发生疏水相互作用形成单螺旋结构，或与淀粉分子形成强氢键相互作用，致使淀粉分子链更易靠近和取向排列，形成局部双螺旋结构；而绿原酸是由咖啡酸与1-羟基六氢没食子酸（奎尼酸）酯化生成的缩酚酸，分子体积较咖啡酸大，其分子结构排列不在同一平面上，与淀粉分子形成单螺旋结构的难度要大于咖啡酸。同时，由于分子的空间位阻效应，绿原酸分子对板栗淀粉分子链的聚集和致密排列起到一定的阻碍作用，致使其淀粉复合物的短程有序程度低于咖啡酸。此外，表3数据也表明，回生后湿热处理淀粉及淀粉-多酚复合物颗粒的R1045/1022值均增大，表面短程有序程度增加，再次证明回生过程中淀粉分子链会进一步聚集重排形成新的有序结构。

图2 板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉以及板栗淀粉-多酚复合物的ATR-FTIR红外光谱图和去卷积图谱Fig.2 ATR-FTIR spectrograms and deconvolution spectrograms of CST，HMT-CST and HMT-treated starch-polyphenol complexes before and after retrogradation

图3 多酚化合物咖啡酸和绿原酸的结构式Fig.3 Structures of polyphenol compounds caffeic acid and chlorogenic acid

表3 板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉及湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的表面短程有序程度、相对结晶度以及层状结构参数Table 3 Surface short-range ordered degree，relative crystallinity and lamellar structure parameters of CST，HMT-CST and HMTtreated starch-flavonoid complexes before and after retrogradation

2.4 湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的结晶结构

图4为板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉以及板栗淀粉-多酚复合物的XRD图。可以看出，板栗淀粉在15.3°、17.3°和23.5°处有较强的衍射峰，在5.73°处有微弱的衍射峰，呈现典型的C型结晶结构［13］。经湿热处理后，板栗淀粉在20.1°左右开始出现较弱的V型特征衍射峰，呈现C+V型结晶结构。这可能是因为湿热处理会造成淀粉分子链断裂，生成的淀粉短直链可以与内源性脂肪酸和磷脂形成淀粉-脂质V型络合物［14］。此外，淀粉-多酚复合物的结晶结构也呈现C+V型结晶特征，并且相对于湿热处理淀粉，在20.1°左右V型特征衍射峰强度增加，表明多酚淀粉复合作用可以促使单螺旋复合物的形成，其分子间有序化排列使淀粉颗粒的某些区域形成V型晶体结构。

对比湿热处理前后板栗淀粉的结晶度变化（见表3）可知，湿热处理后板栗淀粉的结晶度下降，表明湿热处理作用会破坏淀粉颗粒结晶区内双螺旋结构的取向排列及紧密程度，甚至促进淀粉分子链双螺旋结构解旋。这与前面DSC糊化焓的变化趋势一致。这些结构变化导致板栗淀粉更容易被消化酶分解，SDI含量下降而RDI含量上升（见表1）；与此同时，表面短程有序结构和V型结晶结构的形成将抑制淀粉分子与淀粉酶结合，增加板栗淀粉的RI含量。而相对于湿热处理板栗淀粉，多酚复合作用会进一步破坏淀粉的结晶结构，使板栗淀粉的结晶度下降。但是由于板栗淀粉与多酚复合能够形成抗酶解性强的V型结晶结构，因此板栗淀粉复合物的抗消化性能增强。

图4 板栗淀粉、湿热处理板栗淀粉、板栗淀粉-多酚复合物及其回生后的XRD图Fig.4 XRD patterns of CST，HMT-CST and HMT-treated starchpolyphenol complexes before and after retrogradation

此外，回生7 d后所有淀粉样品的结晶度均上升。通过计算淀粉样品回生前后的相对结晶度差值（ΔC）可知，板栗淀粉-多酚复合物的ΔC值均小于湿热处理板栗淀粉，并且咖啡酸复合物的ΔC值小于绿原酸复合物。结合淀粉表面短程有序结构分析结果（见表3）可知，尽管多酚化合物能与淀粉分子通过疏水或氢键相互作用，促进局部短程有序结构的形成，但多酚化合物的存在会阻碍直链淀粉与支链淀粉间相互聚合形成长程有序重结晶结构，因而降低了板栗淀粉的回生程度。相对于绿原酸，分子体积小的咖啡酸在湿热处理过程中更容易与板栗淀粉分子链发生复合作用形成V型结晶，V型结晶复合物又会阻碍直链淀粉析出，故无法为其与支链淀粉提供晶核，从而抑制了淀粉分子链的重结晶［15］。

2.5 湿热处理板栗淀粉-多酚复合物的层状结构

图5为板栗淀粉、回生前后湿热处理板栗淀粉以及板栗淀粉-多酚复合物的小角X射线散射曲线，其层状结构特征参数见表3。由图5（a）可见，板栗淀粉在q=0.68 nm-1左右有一个明显的半结晶层状结构特征衍射峰。根据Woolf-Bragg公式dBragg=2π/q计算淀粉颗粒半结晶片层的厚度（dBragg）［11］，可知板栗淀粉的半结晶层状结构厚度为9.26 nm。相对于板栗淀粉，湿热处理后板栗淀粉及其多酚复合物的层状结构特征峰的分辨率、峰面积和峰强度均显著下降，dBragg值增大，表明湿热处理及多酚复合作用会破坏板栗淀粉的半结晶层状结构，致使板栗淀粉分子链有序化程度下降，层状结构的厚度增大。此外，添加咖啡酸/绿原酸可增强湿热处理对板栗淀粉层状结构中结晶区域的破坏作用，促进淀粉分子链的膨胀和淀粉分支点“柔性空间”的扩大，致使其复合物半结晶层状结构厚度进一步增大，且咖啡酸复合作用对板栗淀粉半结晶层状结构的破坏程度要强于绿原酸。

由图5（b）可知，回生7 d后湿热处理板栗淀粉及湿热处理板栗淀粉-多酚复合物层状结构特征峰的分辨率、峰面积和峰强度相对于回生前样品均增加，表明回生过程中淀粉分子链的聚集重结晶行为有利于提高层状结构中结晶区的有序化程度。但是由于淀粉颗粒的回生现象不明显，在纳米层状结构尺度上，回生前后湿热处理板栗淀粉及板栗淀粉-多酚复合物的层状结构厚度并未发生显著变化。

图5 板栗淀粉、湿热处理板栗淀粉、板栗淀粉-多酚复合物及其回生后的小角X射线散射图Fig.5 SAXS diagrams of CST，HMT-CST and HMT-treated starch-polyphenol complexes before and after retrogradation

3 结论

文中探讨了湿热处理协同多酚复合作用对板栗淀粉消化和回生性能的影响，建立了多酚结构与板栗淀粉-多酚复合物多尺度结构、消化和回生性能之间的作用机制，发现：湿热处理可以提高板栗淀粉的抗消化性能；湿热处理环境中咖啡酸/绿原酸的添加可以促进板栗淀粉局部短程有序结构和V型结晶的生成，提高淀粉的SDI和RI含量，进而改善板栗淀粉的营养价值，同时可以抑制储藏过程中板栗淀粉分子链间聚合形成长程有序重结晶结构，因而降低湿热处理板栗淀粉颗粒的回生性能；咖啡酸/绿原酸对板栗淀粉消化和回生性能的影响程度主要取决于两者自身结构的差异，相对于绿原酸，分子体积小、空间位阻小的咖啡酸对板栗淀粉抗消化和抗回生性能的增强作用更强。文中研究结果可为食品加工中进一步利用湿热处理协同多酚复合改性手段改善板栗制品的消化性能、提高其储藏稳定性能提供理论依据及基础数据，有助于创制满足当前营养健康需求的板栗制品，延长板栗产品的货架期。