乳酸菌菌剂对玉米幼苗的促生作用研究

陈思沅，苟 展，林文槿，彭 鹏，尹少坤，杨 昆，周 佳，贾 峰，李海峰

（河南工业大学 生物工程学院，河南郑州 450001）

玉米是重要的主粮作物，2018年的播种面积在我国达到0.421亿hm2左右（王向博，2021）。玉米等作物需要通过根系从土壤中吸收氮、磷、钾等营养元素维持生长发育，但土壤中可供植物利用的溶解态无机元素浓度偏低，远不能满足植物的需求，因此需要通过施肥补充（尹焕丽，2020；郭永召等，2020）。化肥的生产过程中存在能耗高、环境污染严重等问题，而且过度使用化肥也会导致土壤板结、酸化、地下水污染和磷素流失等问题出现（Liu等，2021；何为媛等，2020；宦月庆，2019）。因此，开发出既利于节能环保与食品安全，又可以提高土壤肥力的微生物肥料是当前的重要任务。

目前，对微生物肥料中发挥作用的功能菌种研究主要集中在解磷菌、解钾菌及固氮菌，这些菌种能溶解土壤中难溶的钾、磷等化合物并将大气中的分子态氮转化为植物容易吸收的形态，从而能提高作物对矿物质元素的利用率，促进作物生长，减少化肥的使用与自然水体的污染（周璇等，2020）。研究发现，乳酸菌广泛存在于乳制品和发酵食品中，能够发酵糖类产生乳酸、草酸、柠檬酸等有机酸（谢玉锋等，2021；马媛等，2019）。其中有机酸的分泌能促进土壤中钾、磷等营养元素的活化，供作物的根系吸收（Yang等，2020）。侯景清（2019）的研究结果表明，乳酸菌菌剂能改良盐碱地并提高土壤中氨态氮、硝态氮和有效磷的含量。王小杰（2019）将小麦种子浸泡在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的菌悬液中，能显著提高小麦种子的发芽率；周游等（2017）向草莓的根际土壤中施加乳酸菌制剂发现，该制剂能明显地提高草莓的株高、茎粗等生长指标。

因此，乳酸菌是除了解磷菌、解钾菌及固氮菌等功能菌株外对植物的生长具有促进作用的菌株，但是目前对乳酸菌菌剂研究的菌种比较单一，主要以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）两种菌种为主（Lamont等，2017）。本研究以不加菌剂处理组为对照，分析以发酵乳杆菌所制备的菌剂对玉米种子萌芽及幼苗的部分生长特性、根系活力与磷含量的影响，以及在幼苗根际土壤中分泌有机酸的种类与含量，为开发乳酸菌作为节能环保的新型微生物肥料提供菌种资源与理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料2020年11月在河南金苑种业有限公司采购品种为伟科702的玉米种子；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）是分离自河南商丘市酵子中的一株乳酸菌，用作本研究的试验菌株。

1.2 培养基MRS液体培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、吐温80 1 mL、柠 檬 酸 铵2 g、CH3COONa 5 g、K2HPO42 g、Mg-SO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸馏水定容至1 L，调pH至6.2，115℃灭菌30 min。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌菌剂的制备 将发酵乳杆菌接种于液体培养基中，发酵乳杆菌菌株的液体培养基在37℃的恒温培养箱中培养24 h，使菌株达到对数生长期，得到发酵乳杆菌的发酵液，测定其OD600为1.90；取其发酵液5 mL，于8000 r/min离心5 min，去除上清液后用蒸馏水洗涤两遍再加入5 mL蒸馏水，制成菌剂LF，其含有发酵乳杆菌的活菌量为3.1×107CFU/mL。本次玉米种子萌芽与盆栽试验设置两个不同的处理组：LF组取LF菌剂5 mL，再加蒸馏水补充至20 mL，CK组则单独施加蒸馏水作为对照。

1.3.2 乳酸菌菌剂对玉米种子发芽的影响 挑选形态完整、饱满、无霉变、无病虫的玉米种子，对玉米种子进行灭菌处理，置于两层湿滤纸的培养皿中，用湿纱布铺盖（黄诗宸等，2018）。于（25±1）℃恒温培养箱中24 h黑暗条件下培养，每隔12 h观察种子发芽情况，玉米种子发芽后48 h内计算发芽率，72 h计算发芽势。发芽率和发芽势的计算公式（毕春竹等，2021）如下：

1.3.3 乳酸菌菌剂对玉米幼苗的影响 用口径为7 cm，高为7.3 cm的塑料花盆，分别称取190 g的土壤并施加液态菌剂，再挑选发芽情况相似的种子种植。每个处理组各4盆，每盆种植4粒玉米，培养条件参考康伟健（2017）。适当浇水并保障光照均匀，培养14 d后测定玉米幼苗的生长特性：单株地上株高、根长、鲜重与干重；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定植株的根系活力（李小方等，2016）；采用过硫酸钾消解法对玉米幼苗的叶片和根部总磷素进行消解，之后与土壤有效磷含量的测定均采用钼酸铵分光光度法进行（GB/T 11893-89，1990）。

1.3.4 乳酸菌菌剂促进玉米幼苗生长机理探究样品前处理：称取LF处理组的土壤0.5 g，加入1 mL提取液（甲醇：氯仿=7:3），混匀后在冰上提取30 min，加入600 μL H2O摇匀，4℃下12000 r/min离心10 min，取上清，重复提取一次；冷冻干燥，加入200 μL甲醇进行复溶，4℃下12000 r/min离心10 min，取上清。样品衍生化：取40 μL样品，加入10 μL 0.1 mol/L 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺与10 μL 0.1 mol/L 3-硝基苯肼；40℃孵育反应30 min。利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，测定LF菌剂下玉米幼苗根系土壤中有机酸种类与含量，液相与色谱条件参考郭山（2018），使用软件TraceFinder处理质谱数据。1.4数据处理 采用Microsoft Excel 2019和SAS 9.2软件对试验数据进行整理分析，采用origin 2021软件作图。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌菌剂对玉米种子发芽的影响 由表1可知，经LF菌剂浸泡48 h（发芽后开始计时）后，玉米种子的发芽率和发芽势均没有显著差异（P＞0.05），但与空白对照（CK）相比，LF处理组中玉米种子的发芽率与发芽势分别提高25.1%与11.5%。Limanska等（2013）使用不同来源的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）悬浮液分别浸泡番茄种子发现，植物乳杆菌ONU991、ONU313与ONU316的悬浮液分别使番茄种子的发芽率提高15.1%、14.4%和13.6%。黄诗宸等（2018）的研究结果表明，经产自乳酸菌的多糖浸泡水稻种子对提高发芽率和发芽势无显著作用，但能促进水稻幼苗的根长。本文的结果表明，使用LF菌剂浸泡后，能明显地促进玉米种子的萌芽，这可能是由于LF菌剂中的有效菌株分泌了植物激素，能释放出有机酸等代谢产物，或者生物酶的种类丰富，进而促进了营养物质的转化。对此，可以进一步探究乳酸菌菌剂的代谢产物等活性物质对种子促萌芽的作用机制。

表1 不同菌剂对玉米种子的发芽率及发芽势的影响%

2.2 乳酸菌菌剂对玉米幼苗生长特性的影响由表2可知，经过LF菌剂处理之后，玉米幼苗的株高、鲜重与干重均有显著的提高（P＜0.05），与CK组相比，分别增加41.1%、48.9%、44.4%；LF处理对根长不存在显著性影响（P＞0.05），但比CK组幼苗的根长提高2.4%。Amaresan等（2021）将微生物菌剂分别接种到番茄与辣椒的根际，均能促进番茄和辣椒的生长，株高分别提高24.8%与43.6%。据报道，在白杨树幼苗的根际土壤施加SK1-7芽孢杆菌菌剂能使白杨树幼苗的鲜重与干重分别提高38.3%与22.7%（Chen等，2020）。本文的结果表明，向玉米幼苗的根际土壤中施加LF菌剂，能明显促进玉米幼苗的株高、根长、鲜重与干重等生长指标增加。可能是由于LF菌剂促进土壤中难溶性磷、钾等元素的溶解，提高土壤中营养元素的含量，供玉米植株的吸收，因此需进行下一步的探究。

表2 不同菌剂对玉米幼苗生长特性的影响

2.3 乳酸菌菌剂对玉米幼苗根系活力的影响由图1可知，经LF菌剂处理后，玉米幼苗的根系活力均显著高于对照处理的数值（P＜0.01），其根系活力可达60.05 μg/g·h，CK组的根系活力为18.01 μg/g·h，根系活力大小为LF组＞CK组。植物通过根系来吸收土壤中的营养物质并且运输到植物的其他部位，根系活力反映根系对水分和营养元素的吸收能力（徐晴等，2016）。Chen等（2020）的研究结果表明，往白杨树幼苗的根际土壤添加SK1-7芽孢杆菌菌剂后，幼苗的根系活力提高31.7%。

图1 不同菌剂对玉米幼苗根系活力的影响

2.4 乳酸菌菌剂对玉米幼苗及土壤中磷含量的影响 由图2可知，LF处理组的玉米幼苗叶片与根部的总磷含量均显著高于空白对照组（P＜0.05），与CK组相比，LF组的玉米幼苗叶片中总磷含量提高19.1%，根部的总磷含量提高4%。此外，经LF菌剂处理能极显著促进土壤中有效磷的释放（P＜0.01），CK组的有效磷含量为0.03 mg/g，而LF组的有效磷含量为0.07 mg/g。植物通过根系吸收土壤中的磷、钾等矿物元素，但这些矿物元素通常以矿石等不溶性化合物形式存在，土壤微生物能通过生物降解将矿物转化成可溶性矿物质。例如，土壤中的解磷菌能把土壤中难溶性磷酸盐转化成有效磷，供植物吸收（安车等，2019）。Lacerda等（2016）从立比草中分离出8株能溶解磷酸盐的乳酸菌，本文所研究的发酵乳杆菌也具有类似的解磷能力。Chen等（2021）发现，在杉木幼苗的根际土壤添加解磷菌菌剂能促使杉木幼苗叶片的总磷含量提高20.0%。Emami等（2020）把小麦内生菌菌剂与根际解磷菌菌剂分别施加于小麦的根际土壤，小麦根际土壤的有效磷含量分别提高24.7%和22.5%，并推测是小麦的根系与菌剂之间相互作用，释放有机酸而导致根际磷利用率的变化。为探明乳酸菌进行解磷的作用机理，本文还进一步对LF菌剂在玉米幼苗根际土壤释放的有机酸种类与含量进行了测定。

图2 不同菌剂对玉米幼苗及土壤中磷含量的影响

2.5 乳酸菌菌剂促进玉米幼苗生长机理探究由表3可知，玉米幼苗根系土壤的有机酸种类主要含有异戊酸、己酸、草酸、乳酸与辛酸等有机酸，含 量 分 别 为2.40、1.73、1.72、1.61、1.15 ng/mg，其余有机酸的含量小于1.00 ng/mg。微生物菌剂中的有益菌可以通过代谢活动产生有机酸，并与土壤中的金属离子形成络合物，促进磷酸盐的释放供作物吸收，还能与矿物表面的阳离子形成复合物从而提高有效磷的含量（池景良等，2021）。据报道，草酸青霉（Penicillium oxalicum）能通过分泌草酸、柠檬酸、甲酸、乳酸和乙酸等有机酸来提高对土壤中磷酸盐的溶解能力（Jiang等，2020）。韩雪娇（2020）的结果表明，西地西菌（Cedecea sp.）能通过分泌α-酮戊二酸、酒石酸等大量有机酸，降低土壤的pH，从而溶解土壤中的磷酸盐。本研究结果表明，LF菌剂在玉米根际发挥作用后，释放的有机酸种类丰富，且含量比较高。因此，乳酸菌与解磷菌等功能菌种一样可以作为植物促生菌，并且具有相似的解磷机理，均能够通过产生高含量的有机酸溶解土壤中难溶性磷酸盐，提高土壤中有效磷的含量，从而对玉米幼苗发挥促生作用。

表3 有机酸的种类及含量

3 结论

本试验结果表明，发酵乳杆菌菌剂（LF）处理对玉米种子萌芽和玉米幼苗的部分生长特性和生理指标均具有显著的促进作用，能有效地提高玉米幼苗的株高、鲜重、干重、根系活力及土壤中有效磷的含量，玉米幼苗根际土壤中有机酸以异戊酸、己酸、草酸、乳酸与辛酸为主，且含量超过1.00 ng/mg。说明乳酸菌具有作为新型功能菌种研制微生物菌肥的潜力，但乳酸菌菌剂对玉米的整个生育期及玉米产量的影响以及促生的作用机制等内容，还需进一步系统的研究。