干细胞在颅骨缺损修补中的应用及研究进展

曹志威 邵国 赵志军 张春阳

1内蒙古科技大学包头医学院（内蒙古包头014000）；2内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科（内蒙古包头014000）；3包头医学院神经外科疾病研究所（转化医学）（内蒙古包头014000）；4内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心（内蒙古包头014000）；5深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心（广东深圳518172）

继发于先天性疾病、创伤或颅脑手术所致的颅骨缺损是神经外科中常见且重要的临床问题。由颅骨缺损引起的认知缺陷、记忆受损、运动障碍以及心理问题在患者中十分常见。关于颅骨缺损修补的研究在近年来取得了很大进展，修补策略包括来自患者自体骨、同种异体骨、异种骨和合成材料。移植材料对取材部位的额外损伤、需要二次手术以及有限可获得性等抑制了自体骨移植的发展［1-2］；同种异体骨移植则受到严重失败率、机械稳定性差和免疫排斥等问题的阻碍［3-4］；而合成材料从钛到羟基磷灰石，有机物质如胶原等，其可能具有优异的机械性能，但它们与宿主骨整合和生长的能力是有限的。

在骨组织工程和再生领域，几种干细胞已经用于治疗颅骨缺损，干细胞成骨分化后移植已被证明是骨再生潜在可行的临床策略，而移植干细胞促进颅骨修复和再生的机制仍存在较大争议［5］。移植的细胞能否在体内长期存活并直接对修复做出贡献，还是它们会在移植后死亡并通过旁分泌效应将细胞因子释放到细胞外［6］，这是目前争论的重点。本文就不同种类的干细胞在颅骨缺损修补中的应用以及该治疗方法的发展前景进行综述。

1 不同种类干细胞在颅骨缺损修补中的应用

1.1 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 长期以来，自体BMSCs一直被认为是研究颅骨修补的理想干细胞来源。一些研究表明，在体外实验中，它可以快速扩增分化为各种中胚层谱系，如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞［7］，这些细胞有助于骨、软骨、肌腱、脂肪、肌肉等间充质组织的再生。此外，BMSCs 也可以分化为外胚层型细胞，例如心肌细胞、内皮细胞（ECs）或平滑肌细胞（SMCs）等［8］。

小鼠BMSCs 已被证明可以修补同基因动物的颅骨缺损［9-11］。在修补过程中，需要合适的载体让BMSCs 停留，首选具有生物相容性和可吸收性的支架构成的载体，其可限制组织排斥反应并允许缺损部位的骨生长。NAUDOT 等［9］利用三维静电纺丝和打印技术制备了蜂窝状聚已酸内酯（PCL）-纳米羟基磷灰石（nHA）复合支架。在大鼠颅骨缺损模型中，该支架和BMSCs 的结合显著改善了骨再生和骨矿化。此外，有研究发现［12］，外泌体能够促进BMSCs 的增殖、迁移和成骨分化，与纯β-TCP支架相比，外泌体∕β-TCP 联合支架可以有效促进颅骨缺损大鼠模型的骨修复和再生。然而，BMSCs 在临床应用中存在一些实际缺陷，包括取材易造成患者痛苦、部位受损，并且随着供体年龄的增加，其增殖和分化能力也会随之降低。

如何改善BMSCs 取材方式，减轻其带来的伤害是关注点之一。近年来，新兴的研究表明，来源于干细胞的外泌体在干细胞旁分泌治疗机制中发挥着重要作用，可能为未来无细胞治疗提供一种全新的思路。

1.2 脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） ADSCs 是一种从脂肪组织中分离出来的基质细胞群，在形态和表型上与BMSCs 极其相似。ADSCs 同样表现出向多系细胞分化的特征，如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞［13］。ADSCs的提取相对容易，可以从皮下脂肪组织中直接获得，与BMSCs 的获取办法相比，该方法成本更低，创伤更小，细胞产量更高，供体部位发病率更低。重要的是，与其他年龄相关的成人干细胞相比，ADSCs 的质量和增殖能力不会随着患者的年龄而下降［14］。因此，作为临床应用的来源，ADSCs 是一种优于其他种类的成体干细胞。

多项研究表明，ADSCs 已成为颅骨缺损修补的可行选择。WANG 等［15］将ADSCs 种植在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架上能够促进大鼠颅骨缺损的修复，同时发现ADSCs 能够分泌血管内皮生长因子（VEGF），VEGF 是血管生成的关键介质，而骨修复过程中需要血管形成，因此ADSCs 对骨形成有很大的促进作用。同样，STUMBRAS等［16］利用富含生长因子的血浆（PRGF）与ADSCs 联合应用治疗兔颅骨缺损，结果显示在骨愈合早期其增强了ADSCs 移植的再生潜能。

1.3 牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）从正畸或者临床拔除的第三磨牙中获得的牙髓干细胞具有分化为外胚层、内胚层和中胚层细胞的能力，并具有无限的自我更新能力［17］。GRONTHOS等［18］于2000年首次从成人第三磨牙中分离了人牙髓干细胞（HDPSCs），体外培养结果显示，HDPSCs 与BMSCs 都具有发展为多细胞系的潜力，但HDPSCs在体外表现出比BMSCs 更高的增殖率。这可能是由于各个组织的发育状态不同，因为第三颗磨牙是最后一颗完全发育和萌出的恒牙，与成人骨髓相比，处于较早的发育状态。

LEE 等［19］将HDPSCs 和BMSCs 分别与可 吸收骨材料（Bio-Oss）相结合，植入兔颅骨缺损处，结果显示，二者具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相关蛋白表达，该体内实验结果表明，移植在Bio-Oss上的DPSCs 与BMSCs 的骨再生效果相当。此外，近期有研究比较了DPSCs 和ADSCs 在体内外的成骨能力［20］，体外结果表明，DPSCs 具有更强的增殖和迁移能力，可表达更高的血管生成相关基因并分泌更多的血管内皮生长因子；ADSCs 能高表达成骨相关基因并有更多的矿物质沉积，展现出了更大的成骨分化潜能。在体内，ADSCs 组在移植后1 周就出现了明显的新骨形成和矿化，而DPSCs 组在移植后3周才开始出现明显的矿化过程。这些结果提示ADSCs可能比DPSCs更有利于骨再生。

DPSCs 作为一种未矿化的结缔组织，在拔除和脱落的牙齿中很容易获取。此外，它们还具有很强的增殖能力与免疫相容性，使其更好地与受体结合。近年来，因其巨大的分化潜能和非恶性表型，牙髓干细胞成为了再生医学领域中临床研究的热点之一。然而，DPSCs 在颅骨缺损修补中的应用还需要进一步的研究。

1.4 人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cell，HAMSCs） HAMSCs 来 源 于胚外中胚层。它们显示出三系分化潜能，表达与多能性相关的标记物，如干细胞特异性转录因子八聚体连接蛋白4（octamer-binding protein 4，Oct-4），并且表达能力比BMSCs 更强［21］。此外，有研究表明，与BMSCs 相比，二者的形态和多向分化潜能几乎一致，但HAMSCs 拥有更强的增殖能力、免疫调节能力［22］和旁分泌特性［23］。

近几年，HAMSCs 在颅骨缺损修补中有大量研究，JIANG 等［24］将HAMSCs 与骨填充材料相结合用于修补兔颅骨缺损，与对照组相比，未见明显的移植反应，细胞能够存活，影像学和组织学结果提示其促进了骨的形成，并加速了骨缺损中的骨矿化。同样，在另一项研究中［25］，使用HAMSCs 与壳聚糖（Ch）-碳酸磷灰石（CA）支架相结合修补大鼠颅骨缺损，发现移植8 周后，其血管内皮生长因子和成骨相关基因的表达明显高于对照组。上述实验提示HAMSCs 可能成为骨组织工程的一种候选种子细胞。

作为成体干细胞中的一种，HAMSCs 因其高活性、高纯度、高增殖和低免疫原性而引起研究者的关注，但成骨能力似乎并没有达到人们的预期，如何提高其成骨能力将是未来研究的重点。

2 提高干细胞治疗效率的途径

尽管以干细胞为基础的治疗方法是颅骨缺损修补中一种极具前景的手段，但此方法在人体内的疗效仍不明确，不能广泛应用于临床，干细胞的植入率和存活率低是主要原因，这可能与颅骨缺损处恶劣的微环境有关。此外，干细胞的搭载材料也是影响治疗效果的一个重要因素。尽管研究者们试图通过应用各种材料来模拟自然骨支架，甚至将含有纳米纤维的大通道支架与间充质干细胞结合［26］以修补颅骨缺损，但疗效喜忧参半。为了克服这些问题，提高干细胞治疗的效率，人们研究了许多不同的方法，现总结如下。

2.1 搭载细胞的仿生工程材料 自20 多年前骨组织工程的概念提出后，颅面骨再生技术得到了飞速发展。在颅骨损伤修补的过程中，可以定制仿生材料来调节细胞所处的微环境，这意味着人们能够通过调整不同生物材料的成分、结构和特性来控制骨再生的速度。

这些生物材料通常由具有生物相容性和可吸收的支架组成，以限制组织排斥反应并为细胞附着、增殖、分化和新组织再生提供合适的环境［27］。这些支架分为无机和有机两种，其中无机支架以磷酸钙（CAP）生物陶瓷为代表，有机支架主要由天然或合成的生物聚合物形成，在这些有机支架聚合物中，人工合成的聚己内酯（PCL）是长期植入物和组织工程支架的极佳候选材料［28］。除此之外，支架的结构和孔隙大小也在促成骨过程中起着重要作用。近年来，电纺支架因其灵活性、易用性、成本效益、对齐结构和控制纤维直径的能力而受到极大关注［29］。

目前，仿生工程材料的选择已成为一个热门领域，众多研究者试图规避各种材料的缺点，并探索新的特性材料来运用到支架制备中，这将是干细胞移植治疗的新趋势。

2.2 生长因子修饰 许多生长因子已被证明在颅骨生长发育过程中起关键作用，包括转化生长因子-β（TGF-β）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和骨形态蛋白（BMPs）［30］。在体内，生长因子通过与不同的细胞外基质分子结合而受到保护。选择合适的生物材料载体系统对单个或多个生长因子的局部和持续释放一直被认为是至关重要的。

目前这些生长因子通常是通过化学或物理方式将其包埋在生物材料里。PATEL 等［31］将VEGF和BMP-2 输送至大鼠颅骨缺损模型中，展示了完全的骨再生能力。此外，近期研究表明，对生长因子进行基因修饰后可以增强支架的功能，RAFTERY 等［32］将改良后的BMP-2 质粒植入胶原羟基磷灰石支架中，能够显著提高支架内搭载的间充质干细胞的成骨能力。

2.3 预处理干细胞 为了提高移植细胞的存活率及在体内的成骨能力，人们提出在移植前对干细胞进行预处理，以减少细胞凋亡，维持细胞在体内的生物学功能，并向特定方向分化。

目前大多数观点主张，将干细胞在体外成骨诱导一段时间后与支架结合移植入体内，这样做的目的在于能够避免体内环境对细胞的影响并使其向成骨细胞特异性分化［33］。然而，一项研究的结果出乎意料，LI 等［34］认为未诱导的ADSCs 也可作为种子细胞用于构建骨组织工程，该实验表明未诱导的ADSCs 与成骨诱导的ADSCs 在新骨形成方面并无明显差异，在体内也能成骨，这种结果或许与细胞状态和材料选择等有一定关系，不过预处理干细胞似乎更被认可。

2.4 多细胞联合治疗 为达到最佳修补效果，有人研究了不同种类的干细胞联合治疗颅骨缺损。JIANG 等［24］利 用HAMSCs 和HBMSCs 都具 有 成骨能力但又有不同方面的优势，使用Transwell 系统对二者进行共培养，结果表明二者共培养时，形成的矿化结节比单独培养更加明显，其成骨标志物的相对表达均显著上调。这些数据说明二者能相互促进成骨，起到更好的治疗效果。此外，另几个研究小组的数据显示，与单一种子细胞相比，ADSCs 与内皮祖细胞（EPCs）共培养可促进大鼠颅骨缺损的血管化骨再生［35］。与单纯3D 打印羟基磷灰石∕凝胶纳米（HAP-GEL）支架相比，通过BMSCs 和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）与3D 打印HAP-GEL 支架材料共培养移植到缺损颅骨处，可增强骨修复能力［36］。

上述结果表明，不同种类干细胞的联合培养提高修补效果是有希望的，细胞-细胞的互补和协同作用，将克服任何单一干细胞类型的不足。

3 总结与展望

颅骨缺损后修补材料及修补风险等问题一直是神经外科探讨的焦点。在缺乏特异性靶向治疗的情况下，目前颅骨缺损的治疗主要依靠各种仿生材料进行修补。基于干细胞的复合支架在许多动物研究中已被证明具有颅骨修复的能力，基因工程、预处理和骨组织工程已被广泛应用于提高干细胞治疗的疗效，多种干细胞的联合应用可进一步提高干细胞治疗的效果。此外，通过改变固有的生物材料特性以调节干细胞在宿主体内命运的创新方法，不仅对促进颅骨再生有重要意义，而且将消除使用生化诱导剂或可溶性因子带来的副作用。综上所述，目前国内外对干细胞治疗的理解以及新兴方法的发现能更好扩大干细胞治疗颅骨缺损的临床应用。