清热退黄灌肠方对新生儿黄疸代谢标志物的影响及其作用机制*

马圆圆，颜佳佳，阮为勇△，步伟全，苏 婕

(1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省宿迁市中医院，江苏 宿迁 223800)

新生儿黄疸是新生儿时期的常见症状，是因为胆红素代谢异常引起血中胆红素水平升高而导致皮肤、巩膜及黏膜黄染。新生儿黄疸《活幼新书》中称为“胎黄”、在《诸病源候论》中述为“胎疸”，其病机多为湿热郁蒸，临床上经过系统辨证后，论治用清热利湿退黄，包括中药或中成药口服[1-2]，如茵栀黄口服液、茵陈蒿汤加减；灌肠[3]的中药汤剂如茵陈蒿汤或各专家自拟汤剂；泡浴[4-5]、辨证推拿[6]、推拿四法[7]、新生儿抚触[8]等。多篇已发表的文献已经论证，中药灌肠、泡浴等中医外治法直接跳过了新生儿服药困难的问题，安全、毒副作用较小，在此病的治疗中得到广泛的应用[9]。既往已有多名学者已经证实了灌肠方法对新生儿黄疸的疗效确切，且本院也在清热退黄灌肠方治疗新生儿黄疸(湿热郁蒸证)疗效做过相关研究[10]、发表过相关论文[11]，在有效结论的基础上，旨在采用代谢组学的方法，筛选出治疗前后血浆差异代谢物，探究灌肠法可能的作用机制。且前期本课题组已用同样的实验方法，对比黄疸儿与健康新生儿2组间血浆代谢物的差异，初步阐释了新生儿黄疸(湿热郁蒸证)的代谢方面的紊乱，为本试验打下了基础。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例来源 本课题入组的20例新生儿是因病理性黄疸在本院NICU住院治疗的足月儿，病例收集时间为：2020年05月至2021年1月。中医诊断标准参照汪受传，虞坚尔主编的《中医儿科学》[12]中“胎黄”湿热郁蒸证。西医诊断标准参照《实用新生儿学》[13]中新生儿病理性黄疸章节。随机将20例患儿分为治疗组、对照组各10例，其一般资料无统计学差异。本试验经过医院伦理委员会批准者(批件号：2019LWKYZ004)，患儿家长知情同意并签署同意书。

1.1.2 治疗方法 对照组：根据病情所需，间断蓝光治疗(浙江戴维医疗器械有限公司蓝光治疗箱)；双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(0.5 g po tid，内蒙古双奇药业)、鲁米那片(5 mg/kg·d，po tid，上海医药有限公司信宜制药)。治疗组：对照组治疗的基础上，予以本试验的清热退黄方灌肠。灌肠方草药来自本院中药房，成分具体如下：茵陈蒿9 g，大黄1 g，栀子5 g，鸡内金8 g，黄柏3 g，茯苓5 g，丹参6 g，在本院制剂室煎熬至40 mL左右，待温度降至37～40 ℃。新生儿先行清洁灌肠，继而予5 mL/kg的灌肠方每日1次，连续使用5 d。

1.1.3 样本采集 2组患儿均在治疗前后分别采集血样送检，采全血2 mL于抗凝管内，进行血浆分离：3000 rpm室温离心10 min，取上层样本0.2 mL，装在1.5 mL容量的离心管中。-80 ℃冷冻保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 实验步骤

1.2.1.1 代谢物的提取 ①取0.1 mL冷冻保存的样本置于eppendorf管中，加入0.4 mL的80%甲醇水溶液。②离心。③取少许上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53%。④重复1次离心，收集上清，进样 LC-MS 进行分析。⑤从每个实验样本中取等量液体混匀作为QC样本。

1.2.1.2 色谱分析 色谱柱：HypesilGoldcolumn(C18)；Column temperature：40 ℃；flow rate：0.2 mL/min；正模式：流动相A：0.1%甲酸，负模式：pH9.0，流动相A：5 mM醋酸铵；流动相B均为：甲醇。

表1 色谱梯度洗脱程序

1.2.1.3 质谱方法 扫描范围选择 m/z 100～1500；ESI源的设置如下：电喷雾电压：3.2 kV；鞘气流速：40 arb；辅助气流速：10 arb；Capillary Temp：320 ℃；极性：正或负；MS/MS二级扫描为data-dependent scans.

1.2.2 数据处理与分析 对质谱分析原数据进行归一化处理、基线滤波、峰识别对齐、积分、保留时间校正，获得所需的保留时间、质荷比、峰强的数据矩阵。因为每种标志物在液相色谱、质谱条件下均有其表现形式，故和大数据库、标准品进行比对后，最终确定生物标志物。采用归一化数据矩阵进行分析：主成分分析PCS、正交偏最小二乘判别法OPLS-DA分析。后者则将多变量、单变量两种方法相结合，筛选出差异代谢物。结合HMDB、KEGG等数据库再筛选一次，后对差异代谢物进行KEGG通路富集分析，研究对比2组治疗后、治疗组治疗前后差异代谢物参与的最主要生化代谢通路和信号转导通路，开展通路功能的研究。

2 结果

2.1 治疗组差异代谢物筛选 进行OPLS-DA建模后，对模型中VIP≥1 且 T-testP<0.05进行差异代谢物筛选，数据归一化后进行聚类分析，再结合人类代谢组学数据库、京都基因和基因组百科全书进一步匹配注释获得代谢物准确信息，共筛选出差异代谢物17种。与治疗前所有样本相比，治疗组治疗后α-酮戊二酸等11种代谢物上调，肌酸酐等6种代谢物下调，见表2。

表2 治疗组治疗后与所有样本治疗前差异代谢物

2.2 治疗组治疗前后差异代谢物代谢通路分析 将所找到的差异代谢物通过KEGG通路富集，且超几何检验P值小于0.05，共找到6种可能的代谢通路，为三羧酸循环、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、赖氨酸生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、胆碱能突触。

2.3 治疗后治疗组与对照组差异代谢物筛选 通过同样的方法，治疗后治疗组与对照组共筛选出差异代谢物15种。与对照组相比，治疗组中N-乙酰-L-天冬氨酸等10种代谢物上调，肌酸酐等5种代谢物下调，见表3。

表3 治疗后治疗组与对照组差异代谢物

2.4 治疗后对照组与治疗组对比代谢通路分析 用同样的方法，共找到3条可能的代谢通路，为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、胆碱能突触丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。

2.5 结果分析 治疗组治疗前后筛选出差异的代谢物17种，主要涉及氨基酸代谢、能量代谢等。代谢通路有6种，涉及的代谢物α-酮戊二酸、1-甲基组氨酸、胆碱等含量均较治疗前上调。治疗后治疗组与对照组筛选出差异代谢物15种，同样为涉及氨基酸代谢、能量代谢。代谢通路有3种，涉及的差异代谢物α-酮戊二酸、L-谷氨酸、胆碱等含量均为上调。说明中药灌肠联合西医治疗新生儿黄疸能够促进氨基酸及能量合成、调节胆碱能通路，对黄疸患儿所发生的代谢紊乱起到调节作用。推测其因，可能与中药灌肠药调整患儿胃肠功能有联系，使对其氨基酸等营养物质的吸收能力增强有关[14]。此外，胆碱能通路具有刺激胃肠蠕动功能[15]，可使患儿纳乳增加，增加能量转化来源，从而增强抗病能力。

3 讨论

目前对于新生儿黄疸中医治疗方案众多，常用的口服有茵栀黄口服液、清热利湿祛黄类的中药汤剂，外治法有中药洗浴、中药灌肠、推拿、穴位按摩等，均取得了一定的疗效，相关疗效类研究及文章较多。但对于中医药治疗新生儿黄疸的代谢组学研究、中医药的治疗机制，文章及相关成果却较为稀少。代谢组学是一个目前研究较少的领域，它能测定多种小分子的浓度，并且适用于几乎所有的生物基质，例如血液、脑脊液、尿液和组织。由于测定的是各种生理和病理过程的代谢最终产物，故代谢组学有可能提供基因组学、转录组学或蛋白质组学等领域无法收集到的信息。代谢组学可实现从微观角度对清热退黄灌肠方治疗新生儿黄疸(湿热郁蒸证)作用机制进行解析，为中医药治疗新生儿黄疸研究提供借鉴，也可以为新生儿黄疸的辨证、治疗等提供新的技术，值得推广和应用。但本研究病例收集的样本量有限，个体差异造成的影响暂不能排除，仍需进一步大样本的验证。同时，其他容易获得的标本如尿液，也可以用本试验的方法，对比尿液治疗前后代谢组学的差异，对比尿液治疗组与对照组代谢组学的差异，来验证血浆代谢组学所得到的结论是否正确，本课题组也将对尿液代谢组学进行进一步研究，以期对新生儿黄疸(湿热郁蒸证)的代谢组学的研究更加的完善、准确。