泌乳牛不同胎次干奶期瘤胃发酵指标与甲烷产量的特征

刘志豪，贾 鹏，赖 琦，董利锋，吴秋珏，高彦华，田忠红，刁其玉*

(1.中国农业科学院饲料研究所/反刍动物及其幼畜营养代谢中美联合研究中心，北京 100081；2.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003； 3.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；4.山东银香伟业集团有限公司，菏泽 274000)

人类活动向环境中排放大量的温室气体是全球变暖和极端气候问题的主要原因。温室气体主要包括二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、氧化亚氮(N2O)等[1]，其中CH4的排放量虽然远远低于CO2，但是造成的危害性远远高于CO2，其增温趋势是CO2的28倍[2]。而反刍家畜胃肠道CH4排放是人类农业活动产生的最主要的CH4排放源之一，其约占农业CH4总排放量的59%，约占世界CH4总排放量的 17%，是绝对不可忽视的一大来源[3-4]。反刍动物瘤胃内微生物降解生成挥发性脂肪酸时产生H2和CO2，产甲烷菌可利用H2生成CH4[5]，这部分CH4将造成奶牛6%～10%的能量损失[6]。因此，降低反刍动物瘤胃CH4排放对于节约饲料能源和减缓全球变暖均有着重要意义。

我国作为奶牛养殖大国，目前奶牛瘤胃CH4排放规律方面已有大量研究，王贝[7]采用六氟化硫(SF6)示踪技术对泌乳早期(391.86 g·d-1)、泌乳中期(399.8 g·d-1)和泌乳后期(395.61 g·d-1)的奶牛瘤胃CH4排放量进行了测定，李斌昌[8]对9月龄(97～118 g·d-1)、12月龄(119～159 g·d-1)、15月龄(194～230 g·d-1)月龄后备奶牛CH4排放量进行了测定，发现随着月龄增加，CH4排放量逐渐增加；王小林[9]则对犊牛(130.6 L·d-1)、青年牛(261.7 L·d-1)和干奶牛(340.5 L·d-1)的 CH4排放进行了测定，发现不同生理阶段奶牛随着年龄和体重增加，CH4排放量极显著增加。目前，国内主流的CH4测定方法为呼吸室测定和SF6示踪技术测定，与前两者相比，GreenFeed测定系统具有自动化、无创、非侵入性的特点，可用于大批量动物的测定，而我国通过GreenFeed测定系统对自然条件下奶牛CH4排放的研究尚处于空白，尤其是对于处于干奶期的不同胎次的荷斯坦奶牛的研究较少。干奶期在奶牛生产过程中至关重要，此阶段牧场往往会调整饲粮配方，奶牛的采食量也会出现降低，这两者的变化会对瘤胃内温室气体排放量产生显著的影响。假设干奶牛的CH4排放量随着胎次和体重的增加而增加，本研究拟通过GreenFeed测定系统，系统测定不同胎次的干奶牛的CH4排放和瘤胃发酵指标，在此基础上建立瘤胃CH4预测模型，旨在探究奶牛瘤胃CH4排放规律，为提高奶牛能量利用效率和开发减排调控方法提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

本试验于2020年10—11月在山东省菏泽市曹县银香伟业公司第三国际牧场完成。

1.2 试验动物与试验设计

本试验选取48头体况健康，处于干奶期的荷斯坦奶牛，按照胎次将试验动物分为4个处理组，每组12头牛，4个处理组如下：一胎牛组、二胎牛组、三胎牛组、四胎及以上组。日粮配方参照NRC(2001)中干奶牛营养需要配置，以全混合日粮(TMR)形式饲喂，日粮的组成及其营养成分见表1。本试验预试期5 d，正试期40 d(产前60 d～产前15 d)。

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.3 饲养管理

试验所有用牛均采用舍饲，每天喂料两次(07:00和15:00)，自由采食和饮水，每天清理剩料，定期清理水槽，保证饲料和饮水的清洁性。所有奶牛的饲喂方式、饲养环境和饲粮均保持一致。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 GreenFeed测定系统 该系统由美国某公司研发，配备有头室、抽风机和颗粒料饲养器，可以在奶牛正常进食条件下，测定奶牛排出的CH4，本研究使用的GreenFeed系统为我国引进的第一套设备。当奶牛采食时，通过激光束保证牛的头部处于正确位置，抽气扇以大约20～40 L·s-1的速度从动物的鼻子吸入空气，系统内的非色散红外分析仪会连续测量空气中的CH4浓度，同时测量空气流量、温度和相对湿度。每次动物访问GreenFeed测定系统时，CH4排放量计算公式如下：

CH4volume(L)=visit time (min)[CH4animal (%)-CH4background (%)]×air flow (L·min-1)[10]

式中：CH4volume——奶牛甲烷的排放量；

visit time——动物测定时间；

CH4animal——测定期间甲烷的平均浓度；

CH4background——背景空气(即测定系统中没有动物访问时)的甲烷的平均浓度；

air flow——测定期间气体的流速；

GreenFeed测定系统收集的数据包括动物测定次数、每次测定时间和持续时间、背景环境中的温度和湿度以及测定时的CH4浓度，并将所获得数据实时上传至服务器，由测定系统生产商进行数据处理后得到最终的测定结果。

1.4.2 基本数据测定 体重的测定：于正式试验结束前5 d，于晨饲前测定每头奶牛的体重。

干物质采食量的测定：在整个试验期间，每天记录投料量和剩料量，计算每头奶牛的日采食量，通过对试验期间采集日粮的干物质含量测定，计算出奶牛每天的干物质采食量。

1.4.3 瘤胃液采集与瘤胃发酵指标测定 于正式试验结束前3 d，晨饲后3 h通过口腔导管的方式采集瘤胃液样品，使用便携式pH计立即测定pH，随即将所取的瘤胃液样品用4层纱布过滤后，分装于2个10 mL离心管，保存于-20 ℃，留待测定挥发性脂肪酸，氨态氮和微生物蛋白。

其中挥发性脂肪酸(VFA)采用气相色谱仪(6890 N, Agilent，美国)测定。色谱柱为HP19091 N-213型毛细管柱，进样口温度为200 ℃，载气为高纯氮气，流量为2.0 mL·min-1。火焰氢离子检测器的温度为250 ℃[11]。

氨态氮(NH3-N)：水杨酸钠-次氯酸钠比色法测定[12]。

微生物蛋白(MCP)：使用嘌呤碱基法进行测定[13]。

1.4.4 瘤胃甲烷排放测定 CH4排放量的测定采用GreenFeed测定系统进行测定。测定过程中，保持每头牛每天最多可访问GreenFeed测定系统4次，每天最少访问2次，每次持续测量时间在3 min以上，每次访问间隔6 h。为保证数据准确性，每头牛需测量30次以上，以其平均值为CH4排放量[14-16]。

1.4.5 饲料样品的采集与分析 于正试期第15～17天，用四分法采集饲料样品，于65 ℃烘箱中烘干48 h后，回潮24 h制成风干样，粉碎后过40目网筛留待测定干物质(dry matter, DM)、粗蛋白质(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(Ash)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)和总能(gross energy, GE)，测定方法参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[17]。

1.5 统计分析

通过Excel 2020进行数据处理，采用SPSS 22.0软件对数据正态分布检验(正态Q-Q图和正态P-P图)和方差齐性检验，剔除异常值后进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行差异显著性分析，采用Pearson相关分析进行相关性分析，采用SPSS构建线性回归模型，试验结果以P<0.05为差异显著，以P>0.05为差异不显著。

2 结 果

2.1 试验干奶牛基本体况

由表2可知，各个胎次的年龄之间均有显著差异(P<0.05)，三胎和四胎及以上组干奶牛的体重、代谢体重显著高于一胎组和二胎组(P<0.05)，而一胎和二胎组之间，三胎和四胎及以上组之间无显著差异(P>0.05)。试验干奶牛的体重随着年龄的增加而增加，代谢体重与体重变化规律一致，干物质采食量的估测数据为12.38 kg·d-1。

表2 试验中干奶牛基本体况

2.2 胎次对干奶牛瘤胃发酵指标的影响

如表3所示，三胎组牛的NH3-N显著高于一胎组(P<0.05)，与二胎和四胎及以上组之间没有显著差异(P>0.05)，一胎、二胎、四胎及以上组的NH3-N也没有显著差异(P>0.05)；一胎和二胎牛的瘤胃微生物蛋白显著高于四胎及以上组(P<0.05)，与三胎组无显著差异(P>0.05)，一胎和二胎之间，三胎和四胎及以上组之间均无显著差异(P>0.05)；一胎组瘤胃中戊酸显著低于三胎组(P<0.05)，与二胎和四胎之间无显著差异(P>0.05)。此外，瘤胃中pH、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和乙丙比在各个胎次之间均无显著差异(P>0.05)。

表3 胎次对干奶牛瘤胃发酵指标的影响

2.3 胎次对瘤胃甲烷产量的影响

由表4可知，干奶牛的CH4排放量的平均值为336 g·d-1，最大值为477 g·d-1，最小值为250 g·d-1，中位数为334 g·d-1。CH4/代谢体重的平均值为2.31 g·kg-1，最大值为3.04 g·kg-1，最小值为1.86 g·kg-1，中位数为2.29 g·kg-1。

表4 干奶牛瘤胃甲烷产量

由图1可知，干奶牛的瘤胃CH4排放量在一胎组最低，三胎和四胎及以上组瘤胃CH4排放量显著高于一胎组(P<0.05)，二胎、三胎和四胎及以上组之间没有显著差异(P>0.05)，一胎组和二胎组之间没有显著差异(P>0.05)；各处理组之间的CH4排放量/代谢体重无显著差异(P>0.05)。

*. 表示相关性显著(P<0.05)，**表示相关性极显著(P<0.01)*. Indicates significant correlation, ** indicates a extremely significant correlation图1 胎次对干奶牛甲烷排放量的影响Fig.1 The effect of parity on methane emissions of dry dairy cows

2.4 干奶牛瘤胃甲烷排放量与体况和瘤胃发酵特征的相关关系

由表5可知，干奶牛的CH4排放量与胎次和体重均有着极显著的相关关系(P<0.01)，而与TVFA、乙酸、丙酸和乙丙比之间没有显著的相关关系(P>0.05)。对CH4排放量和体重进行回归分析可得到方程(图2)。

表5 干奶牛甲烷排放量与体况及瘤胃发酵特征的相关性

图2 基于体重的干奶牛CH4排放量预测模型Fig.2 Prediction equations of enteric methane emissions based on body weight

3 讨 论

3.1 胎次对干奶牛瘤胃发酵指标的影响

瘤胃pH是反映瘤胃酸碱平衡状况和瘤胃微生物所处环境是否正常的重要生理指标，正常范围在6.2～7.0之间[18]，本试验中各个处理组干奶牛瘤胃pH均处在正常范围。NH3-N是微生物合成菌体蛋白的前体物质，瘤胃内氨态氮浓度反映瘤胃内氮代谢的平衡情况，其质量浓度范围在6.58～36.7 mg·dL-1内较佳[19-20]，本试验各个处理组干奶牛瘤胃NH3-N均在此范围内，能够满足微生物蛋白合成所需。瘤胃NH3-N浓度反映了瘤胃内微生物对日粮蛋白的降解速度，其含量既受到日粮组成的影响，也与瘤胃内微生物的利用速率密切相关[21]。本试验中三胎牛的瘤胃氨态氮浓度最高，显著高于一胎牛，这可能是由于一胎组试验牛的瘤胃微生物利用氨态氮合成更多的微生物蛋白，试验测定的结果也表明一胎组牛瘤胃微生物蛋白含量高于三胎组牛。瘤胃挥发性脂肪酸是反刍动物能量利用过程中的重要产物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等，是反刍动物能量的主要来源[22]。瘤胃挥发性脂肪酸主要受日粮组成、日粮加工方式、饲喂方式等的影响[23]。本试验中各个处理组的总挥发酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸均无显著差异，这可能是由于试验中所有干奶牛均采用同样的日粮和饲喂方式，而戊酸虽然在一胎和三胎组之间出现显著性差异，但其占总挥发性脂肪酸的比例极小，戊酸的含量和比例也处在合理的区间范围内。Khazanehei等[24]对二胎和三胎及以上干奶牛的研究也表明，胎次对乙酸、丙酸、丁酸和其他挥发性脂肪酸没有影响，但其研究结果也发现，二胎牛的总挥发性脂肪酸显著高于三胎及以上牛。本试验中，各个胎次干奶牛总挥发性脂肪酸之间没有统计学上的显著差异，但一胎牛的总挥发性脂肪酸最高，这可能是由于与头胎牛相比，经产牛每次采食速度更快，反刍效率更高，咀嚼等量饲料所需时间更少[25]，在短时间内采食大量的饲料和有效咀嚼可能会增加瘤胃通过率，从而通过该途径增加瘤胃通过VFA的能力[24]。

3.2 胎次对干奶牛瘤胃甲烷排放量的影响

CH4是反刍动物摄入的日粮在瘤胃中微生物发酵作用下产生的一种温室气体。本试验使用国际先进的GreenFeed测定系统测定出干奶牛的CH4排放量处于250～477 g·d-1，平均CH4为336 g·d-1。Kasuya和Takahashi[26]的研究表明，干奶牛的CH4排放量处于285.2～396.5 L·d-1，其测定的范围小于本试验结果，这可能是因为本研究所测定的奶牛涉及到各个胎次，体重上有着更大的差异。本研究发现，随着胎次增加，干奶牛的瘤胃CH4排放量也逐渐增加，尤其是三胎组和四胎及以上组干奶牛瘤胃CH4排放量显著高于一胎组，而用单位代谢体重来衡量CH4排放强度时，发现各个胎次组之间的CH4/代谢体重均无显著差异。Neel等[27]的研究也表明，不同体重的牛其瘤胃CH4排放量在用单位代谢体重表示时其差异消失。这表明干奶牛瘤胃CH4排放量的差异可能是由于体重差异所造成的。Huhtanen等[28]基于瘤胃功能建模发现，单位干物质采食量CH4排放量的增加与饲料在瘤胃中的滞留时间、有机物消化率的增强和微生物细胞合成效率降低有关。较大体重的奶牛有着更大的瘤胃容量，减少了摄入对日粮在瘤胃中平均停留时间的影响，导致平均瘤胃停留时间增加。由于奶牛摄入的日粮中较易发酵部分先发酵，平均瘤胃停留时间的增加将会导致日粮纤维素在瘤胃中被消化的比例更大，而更大比例的瘤胃纤维素消化则会导致CH4产量增加[29]。

3.3 干奶牛瘤胃甲烷排放预测模型

反刍动物瘤胃CH4排放量的精准测定是核算温室气体排放和研究减排措施的基础，目前测定反刍动物瘤胃CH4排放量的方法主要包括直接测定法(呼吸代谢室法、六氟化硫示踪法、GreenFeed测定系统等)和间接测定法(CO2示踪法、嗅探器法、激光检测器法等)[16,30]，但无论哪种测定方法，在实际生产中测定CH4排放量都需要耗费大量人力物力，无法对所有动物全部进行测定。因此，需要根据反刍动物实测的CH4排放数据，应用统计方法建立的预测模型，核算排放因子，来预测动物的CH4排放量。本试验结果表明，干奶牛的CH4排放量与胎次(相关系数=0.47)和体重(相关系数=0.61)之间均存在着极显著的正相关关系。Bird-Gardine等[31]对安格斯母牛和公牛的CH4排放量进行测定，发现其瘤胃CH4排放量与体重之间有着显著的相关性，相关系数分别为0.74和0.66；Herd等[32]测定41头安格斯牛的CH4排放量，也得到了相似的结果，相关系数为0.47；Donoghue等[33]测定了不同生长阶段的安格斯牛的CH4排放量，发现其与断奶(相关系数0.53)、一岁(相关系数0.61)和成年后(相关系数0.56)的体重均有显著的相关性；Jonker等[34]在母羊和羔羊上也发现了相似的结果，其利用两种呼吸室测定CH4，发现CH4排放量与体重呈显著的正相关，相关系数为0.31～0.61。这表明反刍动物体重越大，其CH4排放量就越高。在CH4排放量和体重呈极显著正相关的基础上，基于奶牛体重建立的预测模型的决定系数为R2=0.46。Bird-Gardine等[31]在安格斯母牛和公牛也基于体重建立了瘤胃CH4排放量线性预测模型，决定系数分别为0.46和0.26；Huhtanen等[35]在奶牛上的研究也得出CH4排放量与体重之间的预测模型决定系数R2=0.32；Jiao等[36]基于6、12、18和22月龄奶牛的甲烷排放量和体重建立预测模型发现其决定系数分别为0.26、0.34、0.18和0.45；董利锋等[37]对后备奶牛的研究也表明基于体重及建立的CH4预测模型决定系数为0.42。与单一的指标相比，增加预测模型中变量数量，建立多元预测模型有助于提高模型的决定系数，Jenstch等[38]基于日粮中各种可消化营养物质建立的四元一次模型决定系数达到0.896，而Jiao等[36]基于代谢能摄入量、中性洗涤纤维采食量和粗饲料比例建立的三元一次模型决定系数达到0.95，具有较高的模型精度。但在实际生产中，想要大量精确的测得这些指标十分困难，因此有必要使用易于获得的指标来构建高精度预测模型。本试验基于舍饲生理状态和干奶期生理阶段的荷斯坦奶牛，建立适用于我国典型养殖模式的奶牛CH4排放量预测模型，为我国精准核算温室气体排放提供一定的数据，也为研究分析出最佳饲料配方及相关的减排措施提供参考。

4 结 论

在本试验条件下，干奶牛CH4排放量处于250～477 g·d-1，平均CH4排放量为336 g·d-1，随着胎次的增加，CH4排放量呈增加的趋势，一胎最低，四胎最高。此外，CH4排放量与胎次和体重之间呈极显著的正相关，基于体重建立的线性预测模型能够用于反映和评估干奶时期奶牛的CH4排放量。