PCR实验室运行中生物安全隐患分析及应对措施

梅澍 荆晓 何贵山

甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050

PCR实验又称基因扩增实验，通过体外模拟DNA复制过程对病毒体内的基因进行扩增，能够检测出含量不高的病毒，PCR灵敏度和特异性高，临床上常用来检验病毒感染性疾病，如艾滋病、乙型肝炎、高致病性呼吸道病毒等的一种重要检测方法，也逐渐广泛应用于肿瘤靶向、生殖遗传等领域[1-2］。随着近年来高致病性呼吸道病毒的暴发，检测的需求大幅增加，国家加大PCR实验室的建设。PCR实验室属于医学生物安全二级实验室（BSL-2），目前PCR实验室大多数按加强型医学BSL-2实验室建设，对于实验室建设标准相关部门和组织设置了技术要求和指标[3］，从2020年4月至2021年8月，仅甘肃省的PCR检测实验室从46家增至288家。实验室大规模的建设，虽然大大提高了检测能力，但在运行过程中诸多因素会对实验室造成影响。部分实验室受空间及建筑格局限制，普遍存在人流、物流、标本不能完全实现分流或单一流向的问题[4］。实验室检验人员对实验室负压的运行原理及可能产生的危险因素认识不足、培训不到位等，都可能带来生物安全隐患。

1 PCR实验室在运行过程中存在的隐患对实验室的影响

1.1 新风过滤系统对实验室的影响 气流控制是生物安全实验室控制的核心，主要包括对气体流速、流量、压力的检测和控制。特别是加强型医学BSL-2实验室，是在普通型医学BSL-2实验室的基础之上增加了负压，有明确的压力梯度要求，设置机械通风系统、高效排风过滤系统等，该系统要控制送排风比例，维持各房间的负压要求，以保证实验室内的气流由清洁区流向污染区的定向流动[5］。实验室内空气需经过高效过滤后排出，防止实验室内的生物污染外泄，以保证实验室周围环境的安全[3，6］。

目前PCR实验室大部分采用机械通风装置，新风通过初效、中效、高效三级过滤送入实验室，其中初效和中效过滤器可以起到预过滤的作用，进而能够延长高效过滤器的使用寿命。初、中效过滤器一般3至6个月更换一次，高效过滤器的更换频率根据具体使用情况而定[7］。而在西北地区，容易出现浮尘甚至是沙尘暴天气，导致送风系统或排风系统初级过滤器被堵塞。当进风系统压力降低时，导致气流不能定向流动，样品制备间的生物污染因子进入缓冲间后，进而向清洁区扩散，当排风系统过滤器被堵塞后，生物污染因子不能被有效地过滤，会导致实验室污染风险。

实验室核心工作间没有独立排风口，仅利用生物安全柜等其他负压排风装置代替室内排风口，一旦设备操作不当或发生故障，可能导致室内气压或气流逆转。核心工作间送风口、排风口的位置也可以影响气流流动的方向，风口设置可采用对侧上送下排的方式。另外，实验室内设备的摆放位置也可能成为气流流动过程中的障碍。

1.2 压力梯度设置对实验室的影响 负压实验室的生物安全防护性能高于常压状态实验室[8］，临床上PCR实验室常用来检测致病性病毒，实验室应为负压以确保生物安全。PCR实验室存在两类压差控制：一类是各个实验区之间的压差，保证气流的单向流动，避免因不慎同时开启两扇门时的气流逆转；另一类是每个实验区、缓冲间、专用走廊之间的压差，保证每个实验区域各自气流的独立性，避免受到共用通道的影响。

根据生物安全实验室设计的要求，实验室间的压差应在10pa，因此设计与运行时应按>15Pa设置，才能保证负压实验室的压力自清洁区至污染区逐区降低。虽然部分实验室将压差设计成了10pa，而压强的正常漂移可为±5Pa，因此，标本处理间和扩增间压差可能会低于10Pa甚至为5Pa，压差太小，标本处理间和扩增间未形成压力梯度，甚至各缓冲间没有压差，实验室内的气流不能由清洁区向污染区定向流动，具有较大的生物扩散隐患[9］。

1.3 实验分区设置对实验室的影响 由于目前很多实验室是在原有房屋基础上改建的实验室，新改建的实验室因场地限制，没有达到真正意义的三分区，缺少缓冲区，采用内部公用走廊与实验区直接连接，当实验室门开启时，由于温差、门的卷吸和人的裹带作用，必然会产生实验室内空气外泄，会引起短时间、大风量的室内外空气交换，产生交叉污染[5］。

1.4 生物安全柜选择使用不当对实验室影响 生物安全柜作为一级屏障，是PCR实验室的核心设备。PCR实验室需要配备二级生物安全柜，并有独立的通风系统[10］。生物安全柜的操作窗口吸入气流的方向应与房间气流方向一致。送风口位置不应设置在操作人员的正上方和有气溶胶产生的上方，防止含有病原微生物的气溶胶扩散造成污染。通风系统能有效地保证生物安全柜与实验室的压力平衡。生物安全柜的工作原理是保持安全柜内的负压，让气流从外部进入安全柜，同时其循环风和排风经过高效过滤器过滤，既阻止柜内的病原微生物溢出，又能保护实验室环境和实验操作者。当送风系统故障时，压力平衡被破坏，生物安全柜所在的样品制备室的负压，加上生物柜内的负压，会造成压力叠加，让样品制备间成为高负压状态。这种情况在使用全排式B2型生物安全柜的实验室更加突出。这时样品制备室的压力小于PCR扩增室，致使污染因子倒灌入制备间，在室内聚集漂浮，不能及时排除室外，引起严重的安全隐患。

部分实验室操作人员对生物安全柜的使用不当，实验操作过程动作幅度太大引起压力波动，如当压力未达到稳定要求时开始实验操作，快速拉起或关闭窗口玻璃而引起瞬时的风量巨变，会对实验人员造成严重的生物安全隐患。

1.5 实验室洗手设备不合理对实验室影响 部分实验室洗手池排水没有独立的排水系统，并且采用直排方式，没有防回流设计。负压实验室压力小于排水管压力，会造成污水倒吸，管道内的污染因子也会因倒灌漂浮在室内，造成安全隐患。

1.6 消毒不及时对实验室影响 由于PCR实验强大的扩增能力和极高的敏感性，极微量的污染都会出现假阳性，所以防止污染的发生是一个不容忽视的问题[11］。近来，检测需求量大，检测任务重，实验室常常处于超负荷运行状态，甚至是24小时运转，无法停止实验进行及时严格消毒，大大增加了实验室污染的机会。

2 PCR实验室生物安全问题的解决措施

2.1 对实验室设计、维护工程师规范化培训 在进入实验室前应有建筑设计及暖通工程师对实验室的运行原理做培训，一定要模拟在不同的通风及排风状况时出现的压力变化对实验室造成的影响，避免因压力变化可能产生的生物危险因素。如果因沙尘天气导致滤膜堵塞，应及时更换初级滤膜。

排风管道是负压状态，也有可能被致病因子污染，要定期进行消毒处理[3］。实验室内设备的摆放应注意是否影响气流流动，应利于气流由清洁区向污染区的流动，最大限度减少室内涡流与回流。

2.2 对实验室检验人员规范化培训 增强实验室检验人员的生物安全意识和基本操作技能是实验室生物安全管理中的一项重要内容，尤其针对高致病性病毒的检测，实验室更应该具备完善的操作规程、仪器设备使用章程、生物安全培训、应急处置流程等方面的培训。另外，还应该对实验室的设置及运行原理、负压实验室的概念、压力差的设置、压力表的应用等方面进行规范化培训，使实验室检验人员对整个实验室的情况都能熟练掌握。

要求实验操作人员认真观察记录压力变化，将被动的记录实验室压力变为主动的观察压力，及时发现压力表的异常变化，在实验室压差不够的情况下能熟练调节压力表，使每间实验室的压差保持在合理的范围内。实验室人员要充分意识到压力表装错、不调零、压力差不达标等问题所造成严重后果。当压力发生变化时应停止实验，查找原因，排除故障，避免因此造成的生物安全隐患。

2.3 加强人员个人防护，规范工作流程 根据不同病毒的生物安全危害要求，实验室应建立不同等级的个人防护用品使用和管理规范，使用符合相关标准的个人防护用品。实验室管理人员应定期对防护用品的储备、有效期等进行检查和监督管理。

对缺少缓冲间的实验室，人员进入实验室要严格执行三级实验室防护制度。待气压稳定后再进入实验室，进入实验室后应在5分钟后等气压稳定时再开始实验。在实验过程中绝对不允许擅自开门。操作结束后，应让生物安全柜继续运行至少3min来完成柜内空气净化过程[12］，再打开实验室门。

2.4 正确选择和规范使用生物安全柜 在实验过程不涉及有机溶剂或无特殊气体需要全排情况下，建议PCR实验室优先选择A2型生物安全柜[5］。在实际操作过程中，生物安全柜应当始终保持一定的排风量，保证生物安全柜系统的稳定性。实验室检验人员应熟练掌握生物安全柜的原理、操作规范、操作技能，物品摆放原则，操作过程中做到操作缓慢，移动物品时避免交叉污染，避免震动引起的压力波动。

在生物安全柜整个启闭过程中，每一项操作保证相对缓慢、平稳地进行，使压力波动适当地控制在一个可接受的范围内。如果启闭时间足够长，波动风量带来的压差影响会慢慢被抵消，则系统稳定性将大大提高。实验室应当制定严格的操作规程，尽量避免由于快速拉起或关闭窗口而引起瞬时的风量巨变。

2.5 实验室洗手设备的改进 负压实验室洗手池龙头应是免接触型的，防护区的给水管道应设置倒流防止器或其他有效地防止回流污染的装置，并且应设在辅助工作区；给排水系统应不渗漏，下水应有防回流设计，所有围护结构表面除同BSL-2外，缝隙均应密封。实验室的工作区还应配备洗眼装置。

2.6 实验室严格消毒 实验室必须做好严格的清洁消毒工作。对生物安全柜应当定期进行检测、清洁消毒与保养。每日实验前、实验结束后，按照要求对实验室进行严格彻底的清洁消毒，防止实验室污染的发生。

在实验室满负荷运行的情况下，更应该按要求对实验室进行严格消毒。PCR实验前应用75%乙醇对试剂准备区及标本制备区生物安全柜和台面进行消毒后再用紫外线照射30min，然后打开生物安全柜风机运行15~30min，等生物安全柜内形成稳定且洁净的气流循环后开始实验。

3 小结

呼吸道病毒暴发以后，对实验室的生物安全的重视程度有了很大的提高[13］。近两年，实验室的生物安全又提到了新的高度。疫情防控常态化阶段，PCR实验检测工作是疫情防控重要的技术支撑。健全的实验室生物安全体系是确保PCR实验室稳定、高效、安全运行的前提条件和重要保障。针对目前各个实验室存在的问题，实验室在设计设置、人员培训、管理监督等方面还需要进一步的完善和加强，各实验室对人员、设备和物资储备方案仍需进一步细化，应急预案还有待进一步完善。

目前根据疫情防控需求，国内大量PCR实验室投入使用，许多医院是改建的PCR实验室，部分实验室分区设置不合理，实验室存在人流、气流、标本流不能实现单向流动，压力梯度不合格，实验室分散，监管困难等现况。其次，人员培训管理不到位，操作不规范，尤其是新建实验室底子薄，新入岗的实验人员生物安全意识薄弱，专业知识技能还有待提高。为保证实验室环境及检测人员的安全，建议将实验室的运行安全纳入生物安全管理手册，并对实验室进行不定期检查及监管。各地区应高度重视PCR实验室的建设和管理，保证实验室设备仪器的配备和专业检测人员的储备，确保人员安全和实验室安全，为疫情防控做好保障。

面对PCR实验室地域上分散，监管难度大，建议各地区将PCR实验室联网并纳入统一管理，创建智能化、信息化管理的监管平台。通过监管平台对实验室工作环境、区域、工作流程、人员防护、实验检测等各个环节及风险点进行全方位管理和监控，尤其对实验室的压力、人员、标本流动的重要环节等纳入统一监管，提升PCR实验室的监管水平，对可能带来生物安全隐患的各个风险点进行预警，及时发现生物安全隐患并排除隐患，减少或杜绝实验室污染和人员感染，保证实验室的生物安全，同时也保证了实验室的质量控制。