肝内胆汁淤积症血清胆汁酸谱的特征及研究进展

朱时帅 芦曦

胆汁淤积性肝病是指由于各种原因造成的胆汁形成、分泌和排泄障碍，从而导致胆汁流动中断，疏水胆汁酸和其他代谢物在肝脏积聚的病理综合征，根据部位可将其分为肝内及肝外胆汁淤积两种类型。其中，大多数胆汁淤积性疾病是由于肝细胞功能障碍或毛细胆管、细胆管、小叶间胆管病变所致的肝内胆汁淤积[1]。

由于诊断标准未完全统一，胆汁淤积性肝病的发生率尚无准确的数据。2015年曹旬旬等[2]的流行病学调查结果显示，在4660例慢性肝病患者中，胆汁淤积症的患病率为10.26%。胆汁淤积性肝病患者早期可无明显不适，临床上多表现为乏力、恶心、上腹不适等非特异性症状。目前，血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)升高是胆汁淤积最具特征性的早期表现[3]。胆汁酸在肝内合成及分泌，血清总胆汁酸水平升高亦是早期反映胆汁淤积性肝病的一个敏感的经典指标。既往由于其影响因素较多，很大程度上限制了血清胆汁酸的临床应用，故目前国内外相关指南均未将血清总胆汁酸列入诊断标准。随着检验技术的发展，我们发现血清胆汁酸谱的变化而不是总胆汁酸水平，与肝内胆汁淤积性肝病的发生、发展具有一定的相关性，有可能取代血清总胆汁酸成为新的实验室检查指标且有更广泛的临床应用价值。本文对胆汁酸谱的影响因素以及肝内胆汁淤积症患者中胆汁酸谱的特征性变化的病理生理基础进行综述，提示血清胆汁酸谱在肝内胆汁淤积症中的临床应用前景。

一、胆汁酸谱分类及代谢

胆汁酸是胆固醇代谢的最终产物[4]，其在维持肝脏的功能、代谢调节、肝生理学方面起着重要的作用。然而，作为一种两性分子，疏水性胆汁酸可以损伤正常肝细胞膜，导致肝脏损伤。

(一) 胆汁酸合成 在肝脏中，由胆固醇在细胞色素酶家族(cytochrome P，CYP)的作用下通过经典途径(90%)和替代途径(10%)生成初级胆汁酸——胆酸(Cholic Acid，CA)、鹅脱氧胆酸(chenodesoxycholic acid，CDCA)。CA和CDCA一旦合成，即可与牛磺酸和甘氨酸迅速结合形成初级结合胆汁酸。进入肠道后，在肠道菌群水解、脱羟基作用下，初级结合胆汁酸转变为次级游离胆汁酸，主要包括脱氧胆酸(desoxycholic acid，DCA)与石胆酸(lithocholic acid，LCA)[5]。大约95%的胆汁酸通过结肠末端的特定转运体重新吸收并转运到肝脏，这个过程被称为胆汁酸的肠肝循环[6]。在人体肠道中，CYP3A和CYP2家族酶也能将LCA代谢成更易溶解、毒性更低的猪胆酸(hyocholic acid，HCA)和熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid， UDCA)。

(二)胆汁酸转运

1.肝脏胆汁酸转运：在血浆生理pH下，胆汁酸盐主要通过肝细胞基底膜上的钠离子依赖性牛磺酸转运蛋白(taurocholic acid cotransport peptide，NTCP)、非钠离子依赖性有机阴离子转运子家族(organic anion transporter，OATPs)被肝细胞摄取[7-8]，其中，NTCP负责大部分胆汁酸的吸收，而OATPs负责部分游离胆汁酸或甘氨酸结合二羟基胆汁酸的吸收，约占肝细胞胆汁酸摄取的25%。

胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)和多药耐药相关蛋白-2(multidrug resistanceassociated protein-2，MRP2)是毛细胆管膜上主要的胆汁酸外流转运体，介导胆汁酸分泌进入胆汁。此外，肝细胞基底膜上的有机溶质转运蛋白(organic solute transporter，OST)Ostα和Ostβ异二聚体可以介导胆汁酸分泌进入体循环，通过肾脏排泄[7, 9]。在胆管中，结合胆汁酸则可通过顶端钠离子依赖性胆盐转运蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT)进入胆管细胞，并通过胆管细胞基底膜上的Ostα/β异源二聚体分泌到胆管周围丛，在胆汁形成中起一定作用。

2.肠道胆汁酸转运：肠道胆汁酸的重吸收主要发生在回肠末端。在肠道黏膜细胞顶端膜上的ASBT，是人类最主要的肠内胆汁酸盐回收系统[10]。Ostα和Ostβ在回肠细胞基底外侧膜形成功能性异二聚体，介导胆汁酸外流进入门静脉循环，同时，多药耐药相关蛋白-3(multidrug resistance associated protein-3，MRP3)在回肠末端高度表达，为胆汁酸盐进入门静脉循环提供了通路[11]。

二、影响胆汁酸代谢的因素

(一)胆固醇稳态 胆固醇是胆汁酸的合成原料。研究表明，肝脏中胆固醇主要通过四个方面输入：①通过低密度脂蛋白受体介导的细胞内吞作用吸收血清中的胆固醇酯；②通过选择性吸收高密度脂蛋白使胆固醇从外周组织反向转运入肝脏；③通过低密度脂蛋白受体介导机制吸收肠道中的食物胆固醇作为乳糜微粒转运入肝；④由乙酰辅酶A合成胆固醇[12]。以上通路出现障碍均会导致胆固醇的含量变化，进而影响胆汁酸的合成。

(二)基因缺陷 从胆固醇合成胆汁酸需要修饰胆固醇核和氧化胆固醇侧链。常见的胆汁酸合成基因缺陷主要有3β-脱氢酶缺乏症、5β-还原酶缺乏症、CYP7A1缺陷、CYP7B1突变、CYP8B1突变等类型[13]。此外，编码胆汁酸转运蛋白的基因突变也可导致遗传性胆汁淤积。

(三)肝细胞极性 肝细胞极性是胆汁酸动态平衡的另一个关键因素。肝细胞极性调节机制复杂，其中，紧密连接(Tight Junction，TJs)在维持黏膜上皮屏障和通透性方面起重要作用。在胆道疾病的许多病理改变中，均可以观察到TJs屏障功能的丧失和胆汁酸诱导的细胞损伤[14]。

(四)核受体 核受体(nuclear receptors，NRs)是由配体激活的转录因子，它们在胚胎发生、发育和新陈代谢中起着重要作用，其中，多种NRs参与调控胆汁酸的合成和代谢。

法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)在肝细胞和肠道中高度表达，可以被胆汁酸激活。疏水性胆汁酸CDCA是FXR最有效的配体[15]。FXR的激活可导致CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1等细胞色素酶的转录抑制，从而在胆汁酸合成的负反馈调节中发挥核心作用，减少了胆汁酸的合成[1]。同时，FXR的激活除了抑制肝脏胆汁酸的合成外，还通过调节胆汁酸转运蛋白的表达，抑制肝脏胆汁酸的摄取，促进胆汁酸的分泌，从而防止胆汁酸在肝细胞内积聚[16, 17]。

此外，孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)和构成型雄烷受体(constitutive Androstane receptor，CAR)以及维生素D3受体(vitamin D receptor，VDR)可以参与调控CYP家族酶、结合酶和转运蛋白的表达，从而增加胆汁酸的结合力以及促进胆汁酸排泄[18- 19]。胆固醇可以诱导胆固醇7α羟化酶的表达，而这种底物介导的诱导过程是通过肝脏X受体(liver X receptor，LXR)实现的[20]。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，TGR5)是一种由胆汁酸激活的膜受体，可被多种胆汁酸激活，如LCA、DCA、CDCA和CA，并影响胆汁酸稳态[21]。

(五)肠道菌群 初级胆汁酸在肠道菌群的作用下经过水解、脱羟基等反应生成次级胆汁酸，而相关细菌的减少可能会导致微生物区系转化活性降低，进而上调初级BAs的水平，下调次级BAs的水平[22]。肠道菌群的另一个重要作用是参与胆汁酸的异构化，从而改变胆汁酸的疏水性和毒性，保护肝脏免受更多有毒、疏水的胆汁酸的伤害[23]。此外，肠道菌群对肝脏胆汁酸合成及转运也有调节作用[15]。

三、肝内胆汁淤积症中胆汁酸谱的特征

(一)肝细胞性胆汁淤积 肝细胞性胆汁淤积包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎或酒精性肝炎、药物性肝炎、遗传性疾病、妊娠期肝内胆汁淤积症、败血症或毒血症、浸润性疾病、红细胞生成性原卟啉症等。本文将对其中几种疾病中胆汁酸谱的特征进行综述。

1.酒精性肝病：多项研究发现，酒精性肝病患者血清中胆汁酸谱以CA和CDCA增高、牛磺酸结合胆酸(taurine-conjugated cholic acid，TCA)和牛磺酸结合脱氧胆酸(taurine-conjugated deoxycholic acid，TDCA)下降为主。长期酗酒可破坏细胞屏障功能，酒精通过抑制肝细胞膜 Na+-K+-ATP 酶活性及改变质膜的流动性, 使肝脏摄取Na+依赖性胆汁酸盐减少，影响胆汁酸的分泌，这可能是导致CA和CDCA含量增高的原因[24]。同时，酒精可以改变肠道菌群的组成，酒精性肝病患者体内次级胆汁酸减少，或与肠道菌群 7α -脱羟酶活性降低有关[24]。此外，酒精性肝病患者吸收不良，这可能使肠道中菌群发生变化[25]，甘氨酸水解酶相关菌群数量增加，从而导致CA、DCA等游离胆汁酸浓度明显上升，而TCA和TDCA等浓度下降。而由于结合胆汁酸减少，FXR活性降低，FXR/FGF15通路受到抑制，导致血清中总胆汁酸水平进一步增加[26]。

2.代谢相关性脂肪性肝病：有研究认为，代谢相关性脂肪性肝病(metabolism-related fatty liver disease，MAFLD)患者肝脏功能受损，使胆汁酸经肝血窦进入血液内的量增加，而为了维持其正常的胆汁酸肠肝循环, 不得不增加肠肝循环的次数,随着肠肝循环的增加, 又使进入血液中的胆汁酸增多。多项研究表明，MAFLD患者NTCP表达减少，此外，患者体内FXR活性被抑制，对CYP7A1抑制减少，同时FGF19水平降低，导致胆汁酸升高[15]。除胆汁酸受体与转运子改变外，MAFLD患者肠道菌群丰度及数量也发生了变化，牛磺酸代谢细菌增多[27]。以上改变可导致MAFLD患者中总胆汁酸水平变化以次级胆汁酸和结合胆汁酸含量升高为主，其中牛磺酸结合鹅脱氧胆酸(taurine-conjugated chenodeoxycholic acid，TCDCA)升高最为明显。

3.妊娠期肝内胆汁淤积症：相关研究表明，在妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)患者中存在多种胆汁酸转运蛋白及胆汁酸代谢相关受体的基因缺陷。其中，编码MDR3的ABCB4基因缺陷被认为在ICP的发病机制中起主要作用[28]。另一种较为重要的基因是编码BSEP的ABCB11，其第444位氨基酸被替代可导致BSEP蛋白水平降低，从而导致ICP[28]。此外，还检测到存在于胆管膜内的FIC1基因(ATP8B1)和FXR基因(NR1H4)的罕见突变[29]，从而导致FXR减少。

除遗传因素外，妊娠相关激素也可影响ICP患者中胆汁酸的代谢。随着妊娠的进展，血清中孕酮硫酸化代谢产物逐渐升高，其中，硫酸表烯丙孕酮(Epiallopregnanolone Sulfate)PM5S可作为FXR的部分激动剂，减少FXR的反式激活，抑制BA介导的BSEP的表达，导致肝细胞中胆汁酸的积聚[30]。此外，PM5S与另一种孕酮代谢物硫酸别孕酮PM4S均可降低NTCP含量，从而减少牛磺胆酸盐在肝细胞中的摄取[31]。雌二醇也在ICP中发挥作用，其可以激活雌激素受体α，与FXR直接作用，降低FXR的活性，抑制BSEP的转录，并促进CYP7A1的表达[32]。最新研究表明，在妊娠晚期，FGF15、小二聚体伴侣(small heterodimer partner，SHP)和回肠胆汁酸结合蛋白(ileum bile acid binding protein，IBABP)的mRNA在回肠中的表达大大降低，而使用FXR激动剂GW4064治疗可以改善其表达[33]，这进一步证明了ICP患者对FXR通路的影响。

多项研究表明，ICP患者可以检测到CA的特征性上升和CDCA的下降，导致CA/CDCA比率的显著升高，同时，TCA和TCDCA升高，甘氨酸/牛磺酸结合胆汁酸比例降低[34]。

4.遗传性胆汁淤积性肝病：多种遗传性疾病是胆汁淤积的重要病因，其中，进行性家族性肝内胆汁淤积(progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC)可导致血清胆汁酸谱的变化。根据血清中GGT升高程度PFIC可以分为两组。在低GGT水平PFIC中，主要包括ATP8B1(PFIC1)、ABCB11(PFIC2)或TJP2(TJP2缺乏)三种基因缺陷，其中ABCB11主要编码BSEP，TJP2蛋白与细胞定位缺陷和紧密连接结构的破坏有关，以上突变均可使胆汁酸无法分泌进入胆汁[35]。高GGT水平PFIC即为PFIC3，由编码磷脂转运体MDR3的ABCB4基因突变引起，其胆汁酸可以分泌进入胆汁，然而伴有磷脂分泌障碍及胆汁流出障碍，从而引起胆汁淤积[36]。因此，PFIC中胆汁酸谱变化以CA和CDCA升高为主。

(二)胆管细胞性胆汁淤积 胆管细胞性胆汁淤积主要疾病和病因有原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)、囊性纤维化、重叠综合征、移植物抗宿主病、药物性胆管病和继发性胆管性硬化症。其中，发病率最高的是PBC和PSC。

1.原发性胆汁性胆管炎：研究表明，PBC患者中胆汁酸含量增高，以甘氨酸结合鹅脱氧胆酸(glycine-conjugated chenodeoxycholic acid，GCDCA)和甘氨酸结合胆酸(glycine-conjugated cholic acid，GCA)升高为主[34]。PBC患者中存在多种参与胆汁酸代谢的转运体表达或定位异常。Takeyama等[37]发现，在早期PBC患者中，MRP2的mRNA表达水平明显增高。Kojima等[38]发现，部分晚期PBC患者MRP2表达分布紊乱，其回撤至细胞内，而并非定位于肝细胞胆管侧细胞膜上。以上转运体异常均可导致胆汁酸从胆管分泌受阻，从而可能会导致PBC患者血清中初级胆汁酸升高。同时，由于肝细胞胆汁酸分泌受损，可诱发基底外侧胆汁酸外流作为其保护机制，而在胆管中，部分胆汁酸也可被胆管细胞吸收，并通过基底外侧膜上的OSTα/OST β异二聚体分泌到体循环[39]。此外，在PBC前期，毛细胆管和肝内胆管阻塞，后期累及上游肝细胞紧密连接损伤，紧密连接完整性破坏，可使细胞膜的通透性增加，进一步导致PBC患者血清中初级胆汁酸升高，其水平变化可能与病情进展有关。另有研究发现，作为胆汁酸增多的代偿机制，PBC患者BSEP蛋白及mRNA水平均升高，但具体效应尚不明显[40]。

此外，现有研究表明，PBC患者血清初级/次级胆汁酸比值增高。一方面，在胆汁淤积性肝病中，流入小肠的胆汁减少导致次级胆汁酸生成减少，而初级胆汁酸由于前文所述的原因大量增加；另一方面，PBC患者中介导胆汁酸水解、脱羟基的微生物代谢受损，从而导致次级胆汁酸合成减少[41]。实验表明，PBC患者血清中DCA、LCA和TLCA显著低于健康对照组[41]。

2.原发性硬化性胆管炎：胆汁酸是PSC的重要标志物。有研究发现，PSC患者中总胆汁酸水平、初级/次级胆汁酸水平均增高，这可能与肠道菌群密切相关。PSC患者肠道菌群多样性减少，且可以产生水解酶、脱羟基酶的细菌丰度下降，可导致次级胆汁酸生成减少[42]。然而，也有研究发现，经过万古霉素治疗的PSC患者体内次级胆汁酸减少，初级胆汁酸增高，而万古霉素治疗的目标是革兰氏阳性菌，其主要参与初级胆汁酸的脱羟基化，这一发现则证明PSC患者中次级胆汁酸增高[43]。由于相关研究较少，尚无法证明相关研究的正确性。

除了肠道菌群的改变外，在PSC患者中还发现了多种转运蛋白的改变。多项研究表明，PSC患者OSTα/OSTβ、BSEP和MRP3的表达明显上调，同时，多种核受体，特别是FXR、PXR等表达也上调[44]，从而作为代偿机制影响了胆汁酸的合成与代谢。

综上，在肝内胆汁淤积性疾病的诊断中，前提需确定胆汁淤积的存在，目前主要依赖血清学指标，在胆汁淤积性疾病的早期并无黄疸，依赖GGT和AKP其敏感性较差，如PFIC 1和2型及BRIC等患者可无GGT升高，但其胆汁酸谱变化较为明显。现阶段关于血清胆汁酸谱的研究主要集中在酒精性肝病、代谢性肝病、PBC及ICP。我们发现，在疾病同质性的前提下，如遗传代谢性肝病、PBC和ICP，其胆汁酸谱的变化与疾病的进展及预后密切相关，提示其作为一个经典的血清学指标，可能在鉴别胆汁淤积、高胆红素血症和血液系统疾病及病情进展中有更为广阔的前景。

四、总结与展望

肝内胆汁淤积症的诊断和治疗始终是临床中的难点，胆汁酸全程参与其病理生理过程，本文综述了影响胆汁酸代谢的相关因素，以及不同肝内胆汁淤积疾病胆汁酸谱的特征性表现及相关机制，肯定了胆汁酸谱作为肝内胆汁淤积症的标志物的可靠性。但目前尚缺少对疾病进展中胆汁酸谱变化的动态观察。未来的研究可以着眼于进一步明确不同肝内胆汁淤积症中胆汁酸谱的特征，从而确定不同种类肝内胆汁淤积症发生、发展与胆汁酸谱的相关性，为进一步通过血清胆汁酸谱诊断疾病、判断病情严重程度及预后提供实验依据和线索，并为治疗提供新的靶点和思路。