胎儿先天性心脏病遗传学病因的研究进展

姚欣雨，李奉瑾，乔梦茹，张玉萍

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是指在胚胎发育时期胎儿心脏及大血管发育缺陷或停滞导致出生后心血管结构或功能的异常，是胎儿最常见的结构畸形之一。据世界卫生组织统计，每年约有150 万CHD 患儿出生[1]，而我国围生儿CHD 的发病率为2.9‰[2]。2012 年卫生部统计发现，每年新发的CHD 对社会造成的经济负担可达百亿元[3]。CHD类型多样，包括室间隔缺损、动脉导管未闭、肺动脉狭窄、法洛四联症和二尖瓣闭锁不全等。其中，部分CHD 可自行闭合或在胎儿出生后进行手术治疗，但超声发现的胎儿心脏结构异常往往提示与遗传性疾病有关，若其合并染色体或基因异常，出生后可表现为多系统畸形、精神运动异常、生长发育迟缓、代谢性疾病、智力障碍等，目前临床上尚无有效的治疗措施，即使手术纠正心脏结构异常也不能获得正常的生活质量。因此，临床上应对产前超声提示胎儿心脏结构异常的孕妇进行遗传学检测，从而避免遗传因素所致CHD 患儿的出生。研究表明，染色体异常所致心脏畸形占CHD 患者总数的30%[4]。现就胎儿CHD 遗传学病因的研究进展进行综述。

1 CHD 与染色体非整倍体异常

21-三体、18-三体和13-三体是与CHD 有关的常见的染色体非整倍体异常，其中21-三体占52.8%、18-三体占12.8%、13-三体占5.7%[5]。黄杏玲等[6]对181 例CHD 胎儿进行染色体核型分析，检出11%（20/181）的染色体异常，其中8.3%（15/181）为染色体非整倍体异常，2.2%（4/181）为染色体结构异常，嵌合体占0.5%（1/181）。蔡美英等[7]采用染色体核型分析技术对325 例产前超声提示心脏结构畸形的胎儿进行检测，检出14.1%（46/325）的染色体异常，其中染色体非整倍体异常占10.1%（33/325），染色体结构异常占2.1%（7/325）。因此，对产前超声提示心脏畸形的胎儿行染色体核型分析可避免染色体数目及结构异常所致的CHD 患儿出生。

染色体核型分析技术是诊断染色体异常的“金标准”，其是通过G 显带技术检测出染色体的非整倍体异常，不仅可以发现46 条染色体数目异常，还可以检测5 Mb 以上的染色体结构异常，如缺失、倒位、易位、重复及复杂多位点变异等。但染色体核型分析技术依赖细胞培养，实验周期长，易受实验技术条件和制片阅片等影响，不除外细胞培养失败、显带效果不佳等情况而影响结果，且其分辨率低，5 Mb以下的微缺失、微重复不能被检出，从而导致部分染色体微缺失、微重复的出生缺陷被漏诊。

2 CHD 与染色体拷贝数变异（copy number variations，CNV）

随着遗传学技术的发展，诸多研究表明，染色体微缺失、微重复是引起CHD 为首的多种出生缺陷的主要原因之一。CNV 主要是指基因组中1 kb～3 Mb的DNA 片段的插入、重复、缺失和倒位等导致的亚显微水平的结构变异[8]。人类基因组通过非同源末端连接和非等位基因同源重组导致CNV 的发生。CNV具有遗传性和高度异质性等特点，其通过基因断裂、基因位置、基因融合和基因剂量等分子机制，导致孟德尔遗传性疾病或其他复杂疾病的发生[9]。

研究发现，产前超声提示心脏结构畸形、核型分析正常的胎儿中，有3%～10%存在明确致病或可能致病的CNV[10]。吴莉等[11]对65 例染色体核型分析未见异常的心血管畸形胎儿进行检测，7.69%（5/65）发现了可能致病或致病性拷贝数变异（pathogenic copy number variations，pCNV）。Wang 等[12]对602 例CHD胎儿行产前检测，在517 例染色体核型分析正常的CHD 胎儿中，7.7%（40/517）可检出pCNV。随着产前检测技术的发展，染色体微阵列分析技术（chromosome microarray analysis，CMA）与低深度全基因组测序技术（copy number variation sequencing，CNV-seq）实现了对产前微缺失、微重复的检测。

CMA 又称为分子核型分析，其基本原理是将正常组与待测组的DNA 分别用不同颜色的荧光标记，并与探针竞争性杂交来获得定量的拷贝数测序结果。CMA 可在全基因组范围内进行染色体检测，与染色体核型分析相比，其分辨率更高、无需培养细胞，快速准确，可检测出染色体非整倍体异常，同时，还可以检出染色体核型分析无法检测出的微缺失、微重复[13-14]。2013 年美国妇产科医师协会提出CMA适用于超声提示胎儿异常并需要进行侵入性产前诊断的情况[15]。2014 年我国发布《染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用专家共识》提出产前超声发现胎儿结构异常可进一步行CMA 检测[16]。Jansen等[17]的Meta 分析纳入了1 131 例产前超声提示心脏结构畸形并进行遗传学检测的胎儿，结果显示在染色体核型分析正常的胎儿中，CMA 可检出12%的pCNV。Shaffer 等[18]应用CMA 对染色体核型分析正常的580 例CHD 胎儿进行检测，结果显示pCNV 的检出率为7.9%（45/580）。以上结果均表明，超声提示心脏异常的胎儿中，即便是在核型分析正常的情况下，CMA 可额外检测出更多的pCNV。然而，CMA 应用于临床也存在局限性，该技术费用较高、通量低使其在产前诊断中的应用十分受限，且其所使用的芯片探针覆盖不全面，可能会漏诊部分pCNV[19]。

CNV-seq 采用高通量测序技术（high throughput sequencing，HTS）对DNA 样本进行低覆盖度的全基因组测序，并通过比对及分析以检测出样本中的CNV[20]。其无需培养细胞、操作简便、成本低且高通量，可在短时间内完成染色体检测，降低人为的误差。与经典的染色体核型分析对比，CNV-seq 在检出染色体非整倍体异常的基础上，还能额外检测出100 kb 以上的微缺失、微重复，包括大多数已知的pCNV。2019 年我国发布的《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》指出，CNV-seq 可作为首选技术应用于具有产前诊断指征的孕妇[20]。黄杏玲等[6]对181 例CHD 胎儿分别行染色体核型分析及CNV-seq 检测，核型异常占11%（20/181），核型正常的CHD 胎儿中5.0%（8/161）CNV-seq 可检出pCNV。邓新娥等[21]对87 例CHD 胎儿进行检测，其中染色体核型分析检出的染色体异常占12.6%（11/87），染色体核型分析正常的胎儿中10.5%（8/76）CNV-seq 额外检出了pCNV。Richards 等[22]对20 例染色体核型分析正常的CHD 胎儿行CNV-seq 检测25%（5/20）发现了pCNV。以上研究均表明超声提示心脏异常、核型分析正常的胎儿中，CNV-seq 可检出额外的pCNV。

与CMA 相比，CNV-seq 最低仅需要10～50 ng DNA 样本，远低于CMA（200 ng）；CNV-seq 不仅可检出已知的pCNV，还可发现CMA 未覆盖区域的罕见和新发的pCNV，具有更高的分辨率。Liang 等[23]通过对72 例临床样本检测发现，CNV-seq 对于已知pCNV 与CMA 的检出率一致，还检测出CMA 未检出的次级CNV（0.2～0.66 Mb）。Zhu 等[24]对115 例CHD 胎儿羊水分别进行CMA 和CNV-seq 检测，发现18.3%的胎儿CHD 与CNV 有关，结果显示CMA与CNV-seq 对CHD 胎儿常见的pCNV 检出率一致，但CNV-seq 额外检出4 例存在罕见pCNV。以上研究表明CNV-seq 可检出CMA 无法检出的微缺失、微重复。

与CHD 有关的常见CNV 有22q11.2、7q11.23、15q11.2、3p25.1、8p23.1、4q22.1、1q21.1 和16p13.11等。其中，最常见的微缺失综合征为22q11.2 微缺失综合征（22q11.2 microdeletion syndrome，22q11.2DS），也称为颚心面综合征、DiGeorge 综合征，在人群中的发病率约为1/4 000～1/2 000，产前超声提示胎儿心脏结构异常时，其发生率可达1/100，是由于染色体22q11.2 区域有0.7～3 Mb 的小片段缺失所致，其临床表型多样，且变异程度大，常见的临床表现是上颚异常、先天性心脏畸形、独特的颅面特征、学习困难、认知缺陷及精神病发生[25]。据报道22q11.2DS 患者中约60%～75%患有先天性心脏缺陷[26]，主要表现为圆锥动脉干型或主动脉弓缺损。7q11.23 微缺失综合征即威廉姆斯综合征（Williams syndrome），也是与CHD 相关的常见微缺失综合征，是由于1.5～1.8 Mb的小片段在染色体7q11.23 区域缺失所致，其临床表型多样，常见表现为生长迟缓、智力缺陷、心脏缺陷、面部畸形、高钙血症及多动症等[27]。因此，当产前超声提示胎儿心脏畸形，染色体核型分析正常，往往可能患有某种遗传综合征，应对其行CNV-seq 检测，以避免pCNV 的CHD 患儿出生。

3 CHD 与单基因遗传病

虽然染色体核型分析技术联合CNV-seq 或CMA 大大提高了染色体异常所致CHD 的检出率，但仍有部分CHD 病因未明。随着产前检测技术的发展，产前全外显子测序（whole exome sequencing，WES）技术带来了新的思考。WES 是利用探针捕获或扩增技术对全基因组外显子区域进行高通量测序的方法。外显子是指在表达过程中能编码蛋白质的真核生物的核苷酸序列，约占基因组DNA 的1.5%[28]，包含约22 000 个基因，但却包含约85%的已知疾病的相关变异[29]，外显子突变被证明是大多数单基因遗传病的致病原因[30]。

CHD 是最常见的单基因遗传病之一，经各类研究证实，WES 发现NKX2.5、TBX5、GATA4 和ZIC3基因与CHD 有关[31-33]。WES 技术最早应用于儿科，在核型分析及CMA 均正常的CHD 患儿中，WES 可检出额外的致病基因。McElhinney 等[34]对608 例CHD患儿行WES 发现18 例患儿NKX2-5 突变。王珊珊等[35]对62 例房间隔缺损患儿行WES 发现1 例患儿存在TBX5 基因突变。WES 可通过对大多数样本编码区信息进行研究，检出易感病基因位点、致病基因及影响人类发育的新的候选基因。随后，WES 逐渐应用于超声提示结构异常的胎儿产前遗传学诊断。Best 等[36]对1 例复杂心脏畸形的胎儿行WES 发现MAP4K4 基因突变。有研究报道，WES 对出生缺陷的诊断率为30%，远高于核型分析联合CMA 的诊断率（10%）[37]。因此，应对超声提示心脏结构异常且染色体核型分析与CNV 均正常的胎儿行WES，避免致病基因所致CHD 患儿的出生。

然而，将WES 应用于产前诊断也有一定的挑战：产前标本大多来源于羊水，不除外母源性污染；WES 对致病性的判别需依据临床表型、先证者和家系，而产前胎儿表型获取受限，可能造成误判；WES数据库大多来源于患儿与成人，缺乏产前胎儿的表型与有效信息的数据库；其检测时间较长，可能会延误妊娠中晚期孕妇终止妊娠的时间。此外，WES 还可检出临床意义不明的基因突变，当检测出的基因没有临床报道时，很难预估其临床表型与预后，给临床咨询带来了困难。

4 结语与展望

CHD 为各类出生缺陷患儿疾病之首，其发病率呈逐年递增趋势，随着染色体核型分析技术、CMA及CNV-seq 逐步应用于产前诊断，CHD 中染色体异常的检出率大大提高，但仍有部分CHD 病因未明，产前WES 可检出与CHD 有关的致病基因。《胎儿外显子组检测技术在产前诊断中的应用指南》于2020年由美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）发布，它提出对于超声提示胎儿结构异常但核型分析及CNV 检测均为阴性时，WES 技术可作为补充检测。国际妇产科超声协会（ISUOG）指出孕15～18 周可明显观察到胎儿的心脏畸形，因此，可以推荐孕妇在孕15～18 周行胎儿超声心动图，为产前诊断争取足够的时间。对于超声提示胎儿心脏畸形的孕妇，将染色体核型分析、CNV-seq 或CMA 及WES 技术合理联用，优势互补。随着基因组学的快速发展，WES可发现与CHD 有关的新的致病基因，从而为产妇提供更详细的咨询，拟定妊娠及治疗方案。同时，WES检测还有利于进一步完善基因型及表型数据库，为产前诊断胎儿CHD 提供更好的服务。