赖氨酰氧化酶样蛋白 1在癌症中作用机制的研究进展

李 彬，王播勇，王雨娜，杨 娜，自加吉，余 敏，普元倩，熊 伟

1 大理大学基础医学院 生物化学与分子生物学教研室，云南省高校临床生物化学检验重点实验室，云南大理 671000；2 云南大学生命科学学院 生物化学与分子生物学实验室，云南昆明 650091

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族是分泌型的铜依赖性胺氧化酶，由5个成员构成，即LOX、赖氨酰氧化酶样蛋白1 ～ 4(lysyl oxidase like 1-4，LOXL1-4)[1-2](图1)。LOX蛋白家族的成员具有一个共同的保守C端结构域和一个可变的N端前区域。C端结构域包含铜离子结合位点、赖氨酰酪氨酸醌和细胞因子受体样结构域，是其发挥交联胶原蛋白和弹性蛋白催化活性所必需的结构[3]。LOX家族成员N-末端序列具有多样性，LOX和LOXL1含有前结构域，LOXL2 ～ 4组成该家族的一个亚组，参与细胞黏附和蛋白质-蛋白质相互作用。LOX家族蛋白质N-末端从第1位氨基酸开始约20个氨基酸残基通常为信号肽序列，对LOX蛋白的分泌有重要的影响。LOX和LOXL1都含有前导序列，这使得它们可作为无活性的酶原分泌。酶原直接与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相互作用，使酶沉积于弹性组织[4]。LOX家族成员的催化结构域非常相似，可能以相似的方式发挥作用[5]。LOX家族蛋白参与胶原蛋白和弹性蛋白的交联，以及机体发育、损伤、纤维化和癌症发生过程中的基质重塑[6]。LOX和LOXL1均参与胶原蛋白和弹性蛋白的交联，LOXL1的异常表达是许多与ECM合成或降解失衡相关病理过程的基础。本文主要综述LOXL1蛋白的结构、功能及其与癌症发生发展的关系，进一步探讨LOXL1蛋白在癌症研究中的应用前景，为癌症的临床诊断与治疗提供理论基础和参考依据。

图1 LOX家族蛋白质的结构同源性Fig.1 Structure homology of LOX family proteins

1 LOXL1蛋白的结构与功能

LOXL1基因定位于15q24.1，其编码的蛋白质分子量为63 kU。LOXL1基因在主动脉、胎盘、骨骼肌、肾和胰腺中含量最高，这表明LOXL1可能参与维持这些组织结构的完整性[7]。LOXL1在细胞内为90 kU的前体酶原[2]。在其N端信号肽被切割后，LOXL1作为一种前酶在细胞外分泌。分泌型前LOXL1通过其N端前肽结构域结合原弹性蛋白和纤维蛋白-5的C端，定位于弹性发生部位[8]。纤维蛋白-5的作用是将前LOXL1栓系到原弹性蛋白[9]。LOXL1在弹性发生中起关键作用，基因突变将导致皮肤松弛和年龄相关性黄斑变性[10]。LOXL1富含赖氨酸的前肽区域对原弹性蛋白具有最高的亲和力，并通过蛋白质-蛋白质相互作用促进前LOXL1的正确定位和功能。前酶被前胶原C蛋白酶-骨形态发生蛋白1切割以进行催化活化[11]。此外，DNA甲基化、长链非编码RNA、微小RNA和组蛋白修饰均参与LOXL1基因的表达调控。Zeltz等[12]研究发现，LOXL1还受整联蛋白α11调节。环境因素如缺氧、氧化应激和紫外线照射等也可改变LOXL1的表达，这些遗传和环境因素的结合也可能会影响疾病的发展。

LOXL1蛋白可以在机体损伤、纤维化疾病和恶性肿瘤的发生发展过程中促进弹性蛋白的成熟和ECM的重塑，主要机制是将可溶性弹性蛋白单体聚合成弹性蛋白聚合物[9]。最近的研究表明，LOXL1在胶原蛋白的形成中发挥作用，协助维持ECM的平衡[13]。在人类青光眼小梁网细胞中，LOXL1活性的增加有助于弹性蛋白基质积累[14]。假性剥脱综合征患者体外培养的人Tenon囊成纤维细胞显示弹性蛋白的表达增加与LOXL1水平相关[15]。此外，一项对大鼠胎肺成纤维细胞的体外研究表明，LOXL1在弹性蛋白沉积过程中与弹性蛋白基质结合。LOXL1还被证明与体内弹性纤维的功能密切相关。LOXL1基因敲除的小鼠出现多种弹性组织异常，包括皮肤松弛增加、腹主动脉瘤、肠憩室、肺气肿以及盆腔和生殖道脱垂[16-19]。这些现象表明了LOXL1蛋白在ECM稳态中发挥了至关重要的作用，在弹性蛋白的成熟方面尤为显著。LOXL1蛋白的其他作用也被提出，如抑制或促进癌症发生，进一步阐明LOXL1的功能和机制可以为癌症治疗提供新的思路。

2 LOXL1蛋白在癌症发生发展过程中的作用

研究表明，LOXL1蛋白在各种癌症组织和细胞系中呈现不同的表达。与对应癌旁组织或正常组织相比，LOXL1在结直肠癌(colorectal cancer，CRC)[20]中表达显著降低，而在涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)[21]、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)[22]、恶性胸膜间皮 瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)[23]、脑胶质瘤(brain glioma，BG)[24]、前列腺癌(prostate cancer，PC)[25]、胃癌(gastric cancer，GC)[26]、肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)[27]、膀胱癌(bladder cancer，BC)[28]组织中表达显著升高。

2.1 LOXL1与结直肠癌 CRC是常见的恶性肿瘤之一，包括直肠癌和结肠癌。Hu等[20]的研究表明，与正常结直肠癌组织相比，LOXL1在结直肠癌组织中低表达。在体外，沉默LOXL1基因的CRC细胞系显著增强了迁移、侵袭和集落形成的能力，而LOXL1基因的过表达发挥了相反的作用。体内实验结果表明，LOXL1在CRC细胞中过表达显著抑制肿瘤生长和转移进展。机制上，LOXL1通过与正蛋白激酶1/2(mammalian sterile20-like kinase 1/2，MST1/2)相互作用激活MST1/2的磷酸化，进而抑制Yes相关蛋白基因的转录。然而，Sun等[29]从美国国家癌症基因组图谱TCGA数据库中获取数据并通过ULCAN数据库进行在线分析，发现LOXL1和LOXL2基因在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常组织，亚组分析表明在直肠腺癌组织与正常组织中LOXL1基因表达水平差异无统计学意义。以上两个研究从不同方面讨论了LOXL1在CRC中的作用，由于侧重不同，产生了不同的结论，由于癌症的发生发展是一个极为复杂的过程，受多种因素共同作用及调控，因此深入了解LOXL1对CRC的影响对后续诊断及治疗CRC有重大意义。

2.2 LOXL1与涎腺腺样囊性癌 SACC是最常见的涎腺恶性肿瘤，约占所有涎腺恶性肿瘤的22%[30]。基因启动子上CpG岛的高甲基化导致转录抑制。Bell等[21]的研究分析了16例配对的正常组织和肿瘤组织的异常 DNA 甲基化，通过微阵列分析确定了腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)组织中32个高甲基化和7个低甲基化的差异甲基化CpG岛。在LOXL1等5个基因附近的CpG岛上存在低甲基化现象。在14个主要编码转录因子的基因和13个功能不同的基因附近发现了高甲基化。此外，与正常组织相比，肿瘤组织中的高度甲基化基因与发育、凋亡和其他基本细胞途径有关，提示这些基因的下调与ACC的发展和进展有关。CpG甲基化在包括衰老、传染病和癌症在内的一系列生物过程中起着重要的基础作用。评估癌症相关基因中CpG岛甲基化状态可为SACC的临床诊断和治疗提供理论基础和参考依据。

2.3 LOXL1与非小细胞肺癌 NSCLC是肺癌的一种，占肺癌的80%。整联蛋白α11是一种基质胶原受体，促进NSCLC的肿瘤生长和转移，并与肿瘤ECM中胶原的调节有关。Zeltz等[22]研究发现，LOXL1在整联蛋白α11缺乏的小鼠中下调。进一步研究LOXL1与整联蛋白α11关系以及LOXL1在NSCLC中的致瘤作用，通过对患者数据的集中研究，结果表明LOXL1和整联蛋白α11的表达是相关的，并证实整联蛋白α11的缺乏能够下调基质细胞中LOXL1的表达。使用基因敲除LOXL1或过表达LOXL1的癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)，在体外证实了LOXL1在胶原基质重塑和胶原纤维排列中的作用，在体内证实了LOXL1在NSCLC异种移植模型中的致瘤作用。NSCLC肿瘤基质中胶原重塑的结果显示，LOXL1蛋白促进了NSCLC生长和进展。在整联蛋白α11的表达调控下，基质LOXL1是NSCLC发生的决定因素，也可能是NSCLC的一个治疗靶点。Lee等[31]的研究表明，与NSCLC原发部位相比，LOXL1、单羧酸转运体1/2(mono carboxylate transporter 1/2，MCT1/2)和基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase 2/9，MMP2/9)在转移部位呈过表达[31]。过表达LOXL1基因在体内和体外均能够诱导肺癌细胞的转移，而通过siRNA敲低LOXL1基因能够抑制肺癌细胞的转移和侵袭。MCT1/2通过乳酸积累降低细胞外酸性环境pH值并高度激活MMP2/9蛋白表达，进而参与LOXL1相关的癌症转移[31]。这项研究表明LOXL1蛋白可作为抑制恶性肿瘤转移的潜在药物靶点。

2.4 LOXL1与恶性胸膜间皮瘤 MPM是一种高度侵袭性肿瘤，发生于覆盖肺部的胸膜间皮组织[32]。众所周知，MPM的发病主要是由于工业环境中的石棉暴露[33]。Kim等[23]利用肿瘤公共数据库进行了生物信息学筛查，确定了几个可能作为MPM生物标志物的候选基因。通过定量聚合酶链反应，对9例正常胸膜组织和40例MPM组织样本的潜在肿瘤标志物进行分析，结果表明LOX、LOXL1、LOXL2和锌指蛋白FOG家族成员2(zinc finger protein, FOG family member 2，ZFPM2)是MPM的潜在诊断标志物。研究还发现，LOX蛋白家族和ZFPM2具有与纤维蛋白-3(fibulin-3)或间皮素(mesothelin，MSLN)相同的诊断能力，相比硫酸酯酶1(sulfatase 1，SULF1)、血小板反应蛋白2(thrombospondin 2，THBS2)和钙黏蛋白11(cadherin 11，CDH11)更适合作为潜在生物标志物。因此，LOX蛋白家族和ZPFM2可作为新的MPM诊断生物标志物，为MPM的临床诊断提供更有利的参考依据。最近，我们的研究通过RTqPCR检测发现，与配对正常胸膜组织相比，12例MPM组织中LOXL1和LOXL2基因mRNA的表达量均显著增加[34]。LOXL1和LOXL2基因高表达和肿瘤类型是导致MPM患者预后不良的独立因素。此外，LOXL1基因与LOXL2、LOXL4基因表达呈显著正相关[34]。

2.5 LOXL1与前列腺癌 PC是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤。在世界范围内，男性所有恶性肿瘤中前列腺癌的发病率居第2位，严重危害男性健康[24]。LOX和LOXL1是ECM沉积和成熟的关键酶。Wang等[24]研究发现，LOX家族蛋白质在前列腺癌中促进肿瘤进展和转移，也具有抑制肿瘤的作用。研究显示，原位植入大鼠前列腺癌AT-1细胞增加了肿瘤和周围非恶性前列腺组织中的LOX和LOXLs mRNA表达，提示这些酶可能在前列腺癌的进展中发挥作用。在体外缺氧培养24 h的AT-1细胞中LOX、LOXL1和LOXL2mRNA水平显著高于常氧对照组，提示大鼠肿瘤组织和非恶性前列腺组织中这些LOX家族酶的上调可能是由于缺氧所致。植入AT-1细胞之前，用β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，BAPN)抑制LOX蛋白表达，可抑制肿瘤生长。相反，在肿瘤形成后开始治疗，会导致肿瘤生长不受影响或促进肿瘤生长。此外，当静脉注射肿瘤细胞时，BAPN治疗并不能抑制肿瘤自发淋巴结转移的形成。胶原蛋白是LOX的靶点，在肿瘤组织和肿瘤临近的前列腺组织中可以观察到胶原纤维含量的暂时性下降，这提示早期BAPN治疗在抑制肿瘤生长方面比后期治疗更有效。研究结果表明，LOX家族蛋白质的功能与环境有关，在前列腺癌中分别表现抑制肿瘤和促进肿瘤的特性。抑制LOXL1蛋白作用有望作为前列腺癌治疗的一种潜在方式。

2.6 LOXL1与脑胶质瘤 BG约占成人原发性恶性脑肿瘤的70%，其特点是复发率高和5年生存率低[35]。由于血-脑脊液屏障的存在，目前临床治疗脑胶质瘤的有效方法几乎局限于替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化疗和电离辐射(ionizing radiation，IR)[36]。胶质瘤细胞也可以获得抗凋亡活性，使目前的治疗方式无效。因此，靶向抗凋亡因子可能是提高胶质瘤患者生存率的好方法。研究发现，LOX家族蛋白质与脑胶质瘤的发生发展密切相关。Li等[37]检测了30例配对的脑胶质瘤组织和正常组织中LOXL1基因的表达水平，发现LOXL1在恶性胶质瘤组织中显著高表达，并通过Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤细胞U87和U251的增殖。Yu等[25]通过TCGA数据库进行了挖掘，分析表明LOXL1基因表达水平越高，脑胶质瘤恶性程度和肿瘤进展越严重。通过细胞水平和动物水平的功能获得和功能丧失实验，研究LOXL1在促进胶质瘤细胞存活和抑制细胞凋亡中的作用。研究发现LOXL1通过与多种抗凋亡调节剂，特别是BAG家族分子伴侣调节因子2(BAG family molecular chaperone regulator 2，BAG2)相互作用而表现出抗凋亡活性。LOXL1-D515通过氢键与BAG2-K186相互作用，其赖氨酰氧化酶活性通过与K186泛素化竞争，阻止BAG2蛋白发生降解。此外，研究发现LOXL1的表达通过VEGFR/Src/CEBPA信号轴特异性上调。临床上，血液中LOXL1水平较高的患者，脑胶质瘤组织中BAG2蛋白含量更丰富。总之，LOXL1作为一种重要的调节因子，可以增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，靶向LOXL1的方法是治疗脑胶质瘤的一种潜在策略。此外，血液中LOXL1可作为监测胶质瘤进展的生物标志物[25]。

2.7 LOXL1与胃癌 GC是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，是全球第三大癌症致死原因。Kasashima等[38]通过免疫组织化学研究了597例原发性胃癌的临床病理特征与LOX家族成员(LOXL1、LOXL3和LOXL4)之间的相关性，结果显示，LOXL1、LOXL3、LOXL4的表达与T浸润、淋巴结转移、淋巴及静脉浸润有关。LOXL1基因的表达水平与GC组织学类型和体内生长方式有关。LOXL1阳性表达的胃癌患者的总生存期显著低于LOXL1阴性表达患者[38]。Hu等[26]研究显示，LOXL1在胃癌组织和细胞中呈高表达，并且与胃癌患者预后差显著相关。基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)发现，LOXL1基因表达与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关的基因表达呈正相关。与一般的胃癌组织和胃癌细胞系相比，LOXL1在腹膜扩散的胃癌患者肿瘤组织和细胞系中过表达。LOXL1过表达降低E-钙黏蛋白(cadherin 1，CDH1)表达，增加波形蛋白(vimentin，VIM)、N-钙黏蛋白(N-cadherin，CDH2)、Snail家族锌指转录因子2(snail2，SNAI2)和丝束蛋白3(plastin 3，PLS3)的表达，并促进胃癌细胞的迁移。过表达LOXL1的胃癌细胞将它们的形态改变为纺锤状形式。此外，LOXL1 mRNA高表达与低分化的组织学类型、淋巴结转移相关，并且是一个独立的预后不良因素[26]。梁金娥[39]的研究表明，LOXL1基因的表达水平在不同临床病理学特征之间存在差异，LOXL1倾向于在T分期较晚的胃癌患者中高表达。LOXL1通过WNT/β-catenin/cyclin D1通路促进胃癌细胞增殖，但LOXL1的表达并不影响胃癌细胞的侵袭和迁移。以上研究结果提示，LOXL1蛋白在胃癌中主要发挥促癌作用。然而，Chen等[40]的研究认为LOXL1基因是胃癌发生中候选的甲基化沉默的抑癌基因。爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)阳性胃癌细胞系中LOXL1的甲基化频率显著高于EBV阴性胃癌细胞系。胃癌中抑癌基因LOXL1的启动子区呈现高甲基化状态，说明EBV是LOXL1基因调控区甲基化的关键原因。结果提示EBV参与了EBV阳性胃癌的发病机制，即LOXL1基因启动子CpG岛发生异常甲基化，使抑癌基因失活[40]。

2.8 LOXL1与肾细胞癌 RCC是一种起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，为泌尿系统最常见的肿瘤之一。VHL综合征(von hippel lindau，VHL)是一种常染色体显性遗传的遗传性疾病，其中RCC是VHL综合征导致的主要肿瘤类型，VHL综合征患者在60岁时罹患RCC的风险约为70%[41]。VHL综合征与VHL肿瘤抑制基因中的各种错义种系突变有关。LOXL1 mRNA 在VHL基因突变的肾细胞癌细胞株中表达下调，认为LOXL1表达的缺失与RCC的发生有关，但具体的分子机制尚不清楚[27]。

2.9 LOXL1与膀胱癌 启动子高甲基化是导致多种人类癌症基因沉默的常见机制之一。Li等[28]通过药理学和微阵列技术的结合在BC细胞中鉴定了59个候选高甲基化基因，发现LOXL1是一种候选甲基化基因，在BC细胞系中经常发生基因沉默，并且这种沉默主要与启动子甲基化有关。在原发性膀胱肿瘤中，LOXL1和LOXL4常发生高甲基化导致表达缺失。研究表明，BC中存在LOXL4基因的体细胞突变，但没有发现LOXL1基因的突变。此外，将LOXL1和LOXL4基因重新导入人类膀胱癌细胞会导致集落形成能力下降。进一步的研究表明，LOXL1和LOXL4基因的过表达可拮抗Ras激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路。因此，该研究表明LOXL1基因可以作为肿瘤抑制基因，通过抑制BC中的Ras/ERK信号通路发挥其功能。

3 结语与展望

随着现代医学的发展，癌症的治疗手段日趋多样，包括手术、射频消融、肝动脉化学栓塞术、全身化疗、靶向治疗和免疫治疗等，患者的预后也得到改善，但目前癌症治疗仍是医疗领域的棘手问题。LOXL1基因作为一个潜在的治疗靶点，在多种类型癌症发生发展过程具有重要的作用。可能与肿瘤细胞的起源、分化程度及遗传因素有关，同时LOXL1在不同癌症中的表达差异可能也与肿瘤间质细胞之间的相互作用和ECM的稳定性以及LOXL1本身多样化的生物学活性有关。然而，目前LOXL1基因抑癌或促进癌症转移的作用机制尚未完全明确，这些亟待解决的问题也为进一步研究LOXL1基因的作用机制拓展思路，从而寻找预防癌症和控制癌症转移的新方法。