miR-25-3p和ZEB2在宫颈癌中表达的临床意义及对宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用探讨

吴小颖，陈彤华，邢增丽，黄 霞，邢雪凤

1 四川大学华西三亚医院 妇产科，海南三亚 572000；2 海南医学院第一附属医院 产科，海南海口571000

宫颈癌是全球最致命的妇科恶性肿瘤之一，发病人数逐年增加，且85%的死亡病例发生在发展中国家[1-2]。尽管宫颈癌治疗已取得了很大进步，但患者的预后普遍较差[3]。微小RNA-25-3p(microRNA-25-3p，miR-25-3p)是与肿瘤密切相关的miRNA，在子宫内膜癌和三阴乳腺癌等恶性肿瘤中被报道为促癌因子[4-5]；而在食管癌恶性肿瘤中被报道为抑癌因子[6]；在宫颈癌中miR-25-3p通过逆转上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感度[7]。锌指E盒结合的同源盒蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)属于结合E-box的锌指蛋白家族，在肿瘤发生和发展中发挥多种作用[8]。ZEB2在宫颈癌中高表达，并促进宫颈癌的增殖和侵袭能力[9]。miRNA主要是通过调控其靶基因发挥生物学作用[10]。我们采用Target Scan7.1软件预测ZEB2是miR-25-3p的靶基因，而miR-25-3p能否通过靶向ZEB2在宫颈癌进展中发挥作用尚不清楚。本研究旨在分析miR-25-3p与ZEB2在宫颈癌中表达的临床意义和相关性，并进一步分析miR-25-3p调控ZEB2在宫颈癌中的作用。

资料与方法

1 研究对象 纳入四川大学华西三亚医院2013年1月- 2014年12月治疗的宫颈癌患者84例，获取病理组织。另收集因良性疾病切除的正常宫颈组织40例作为对照组。所有患者或家属均签署知情同意书，本研究由四川大学华西三亚医院伦理委员会审核通过。纳入标准：1)经病理检查确诊患有宫颈癌；2)入组前未进行手术、化疗、放疗等抗肿瘤治疗；3)患者临床病理资料和随访资料完整。排除标准：1)患有其他器官原发和转移肿瘤；2)合并有心、肝、肾等重要脏器功能障碍；3)合并有血液系统疾病、免疫功能障碍。

2 研究对象分组及观测指标 以实时荧光定量PCR检测miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相对表达量。统计患者5年随访资料，随访方式为门诊复查和电话随访，分析患者的5年总生存(overall survival，OS)率。分组设计：1)按照miR-25-3p在宫颈癌组织中平均的相对表达量0.7为界，将84例宫颈癌患者分为miR-25-3p≥0.7高表达组(39例)和miR-25-3p＜0.7低表达组(45例)。2)以ZEB2 mRNA在宫颈癌组织中平均相对表达量1.33为界，将84例宫颈癌患者分为ZEB2 mRNA≥1.33高表达患组(43例)和ZEB2 mRNA＜1.33低表达组(41例)。3)根据ZEB2蛋白在宫颈癌组织中的表达情况将其分为ZEB2蛋白高表达组(48例)和ZEB2蛋白低表达组(36例)。

3 实验试剂与仪器 TRIzol®试剂，日本Takara公司；陶瓷研钵，河北鼎盛隆华实验仪器有限公司；三氯甲烷、异丙醇和乙醇，天津风船试剂有限公司；EP管和枪头，美国Axygen公司；DEPC水，北京索莱宝公司；Nanodrop2000分光光度仪，美国Thermo公司；逆转录试剂盒，美国Fermentas公司；OneStep RT-PCR Kit试剂盒，德国QIAGEN公司；miR-25-3p、ZEB2和内参GAPDH引物，上海捷瑞生物工程有限公司；7500荧光定量PCR仪，美国ABI公司；DAB显色试剂盒，丹麦DAKO公司；ZEB2一抗，美国proteintech公司。HeLa细胞，上海科学院细胞库；细胞培养基、FBS和胰酶，美国Gibco公司；miR-25-3p mimic、ZEB2-wt(野生型)和ZEB2-质粒mut(突变型)，上海吉凯基因有限公司；MTS试剂，英国Abcam公司；Boyden小室，美国BD公司。

4 实时荧光定量PCR检测miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相对表达量 将冻存的上述患者手术组织标本放入研钵中研磨成组织粉末后，加入TRIzol®试剂将组织移至EP管中，加入三氯甲烷混匀，静置后高速低温离心30 min，吸取上层上清液移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇混匀后高速低温离心30 min，乙醇洗1次，加入DEPC水溶解RNA，经Nanodrop2000测得其浓度。按照Fermentas逆转录试剂盒，以85℃ 5 s，37℃15 min反应条件将RNA逆转为cDNA。以cDNA为模板，按照OneStep RT-PCR Kit试剂盒以95℃30 s和40个60℃ 30 s，72℃ 30 s循环进行PCR反应。7500荧光定量PCR仪检测各个样品的循环阈值(threshold cycle，Ct)。以GAPDH基因为内参，用2-ΔΔCt法 计 算miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相对表达量。引物序列，miR-25-3p引物F：5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，R：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；ZEB2引物F：5′-CAAGAGGCGCAAACAAGCC-3′，R：5′-GGTTGGCAATACCGTCATCC-3′；内参GAPDH引物F：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

5 免 疫 组 化(immunohistochemical，IHC)检测ZEB2蛋白的表达 石蜡包埋的4 µm切片在60℃下烘烤2 h，采用二甲苯脱蜡15 min，放置递减的乙醇进行水化，放置枸橼酸钠修复液中高压100℃煮3 min进行抗原修复。PBS洗3次，每次5 min，采用10%山羊血清孵育石蜡切片30 min进行非特异性抗原封闭，与ZEB2一抗4℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5 min，与二抗孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，添加DAB显色液进行显色。显微镜下观察显色，出现棕色时，将切片浸入蒸馏水中终止反应。放置苏木素中染色2 min，放置递增的乙醇中脱水并固定。对染色结果进行评分：1)肿瘤组织中阳性肿瘤细胞的百分比：0(0)，1(1% ～ 10%)，2(11% ～ 50%)，3(51% ～70%)和4(71% ～ 100%)；2)染色强度：0(无)，1(弱)，2(中)，3(强)。染色分数为阳性肿瘤细胞的比例 × 染色强度(0 ～ 12)。＞6分为ZEB2高表达，≤6分为ZEB2低表达。

6 HeLa细胞培养与转染 宫颈癌细胞HeLa复苏后重悬至含有10% FBS的高糖培养基，放置细胞孵育箱中培养。每隔1 d更换1次培养基，48 h采用胰酶消化，进行细胞传代。以1.5 × 105/孔的细胞密度接种至6孔板中，分为NC组、miR-25-3p mimic组和miR-25-3p + oe-ZEB2组，放置细胞培养箱中培养12 h后，进行细胞转染。NC组转染lip2000和NC mimic，miR-25-3p mimic组转染lip2000和 miR-25-3p mimic，miR-25-3p + oe-ZEB2组转染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2过表达质粒，转染48 h后进行后续的实验研究。

7 miR-25-3p靶向调控ZEB2的检测 Target Scan7.1软件(http://www.targetscan.org)预测miR-25-3p与ZEB2的3’UTR区存在结合位点。HeLa细胞以4 000/孔的细胞密度铺至96孔板中，培养24 h后，NC + ZEB2-wt组细胞转染lip2000和NC mimic、ZEB2-wt质粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-1-wt组细胞转染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-wt质粒，NC + ZEB2-mut组细胞转染lip2000和NC mimic、ZEB2-mut质粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-mut组细胞转染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-mut质粒，放置细胞培养箱中培养12 h后更换培养基。转染48 h后采用双荧光素酶报道基因检测试剂检测各组细胞荧光素酶活性。

8 MTS实验检测细胞增殖 收集NC组、miR-25-3p mimic组和miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞，以1 500/孔的细胞密度接种至96孔板中，每组设置6个复孔，放置细胞孵育箱中培养12 h后，每孔加入20 µL MTS试剂，并在细胞孵育箱中继续培养2 h后，采用全酶标仪检测样品在490 nm处的OD值(吸光度值)。

9 Boyden实验检测细胞侵袭 收集NC组、miR-25-3p mimic组和miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞，无血清细胞洗3次后，以1.5 × 105/孔的细胞密度接种至96孔板中，每组设置6个复孔，放置细胞孵育箱中培养0 h、24 h、48 h和72 h后，每孔分别加入20 µL MTS试剂，并在细胞孵育箱中继续培养2 h后，采用全酶标仪检测样品在490 nm处的OD值(吸光度值)。

10 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，采用独立样本t检验比较两组间的差异；多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD-t检验。以Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验，分析miR-25-3p和ZEB2的表达水平对宫颈癌患者预后的影响。Pearson线性相关分析宫颈癌组织中miR-25-3p与ZEB2表达的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 研究对象一般情况 患者的平均年龄为(57.38±10.98)岁，≤55岁33例，＞55岁51例；组织类型：鳞癌60例，腺癌24例；组织学分级：低级39例，中高级45例；肿瘤直径：≤4 cm 50例，＞4 cm 34例；淋巴结转移：有淋巴结转移40例，无淋巴结转移44例；肌层浸润深度：浅肌层55例，深肌层29例；脉管癌栓：有脉管癌栓21例，无脉管癌栓63例；FIGO分期：Ⅰ ～Ⅱ期40例，Ⅲ ～ Ⅳ期44例。对照组平均年龄为(56.58±12.06)岁，≤55岁16例，＞55岁24例。

2 宫颈癌组织中miR-25-3p、ZEB2表达水平与患者临床病理参数之间的关系 miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达水平与患者的年龄、组织类型、组织学分级、肿瘤直径和脉管癌栓均无关(P＞0.05)，与淋巴结转移、肌层浸润深度和FIGO分期相关(P＜0.05)。ZEB2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达水平与患者的年龄、组织类型、肿瘤直径、肌层浸润深度和脉管癌栓均无关(P＞0.05)，与组织学分级、淋巴结转移和FIGO分期相关(P＜0.05)。见表1。

表1 miR-25-3p和ZEB2在宫颈癌组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系Tab. 1 Relationship between expression levels of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer and clinicopathological parameters

3 宫颈癌组织中miR-25-3p、ZEB2表达水平对患者预后的影响 84例宫颈癌患者中死亡55例，存活29例，5年总生存(overall survival，OS)率为34.52%。miR-25-3p高表达组的5年OS率为43.59%，miR-25-3p低表达组的5年OS率为26.67%，低表达组预后较差(P＜0.05)。ZEB2mRNA高表达组5年OS率为25.58%，ZEB2 mRNA低表达组5年OS率为43.90%，高表达组预后较差(P＜0.05)。ZEB2蛋白高表达组5年OS率与mRNA组趋势一致。见表2，图1。

图1 Kaplan-Meier生存曲线分析miR-25-3p和ZEB2表达对宫颈癌患者预后的影响Fig.1 Kaplan-Meier survival curve analysis of the effect of miR-25-3p and ZEB2 expression on the prognosis of cervical cancer patients

表2 不同miR-25-3p、ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白表达水平宫颈癌患者生存比较(n, %)Tab. 2 Comparison of survival of cervical cancer patients with different levels of miR-25-3p, ZEB2 mRNA and ZEB2 protein expression (n, %)

4 qRT-PCR检测miR-25-3p、ZEB2 mRNA在宫颈癌组织中的表达水平 qRT-PCR检测84例宫颈癌组织和40例宫颈正常对照组织中miR-25-3p、ZEB2 mRNA的表达水平。结果显示，miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达(0.70±0.22)显著低于其在宫颈正常对照组织中的表达(1.00±0.26)，差异有统计学意义(t=6.687，P=0.000)。ZEB2 mRNA在宫颈癌组织中的表达(1.33±0.43)显著高于其在宫颈正常对照组织中的表达(1.00±0.31)，差异有统计学意义(t=4.864，P=0.000)。

5 IHC检测ZEB2蛋白在宫颈癌组织中的表达水平 IHC检测84例宫颈癌组织和40例宫颈正常对照组织中ZEB2蛋白的表达水平。结果显示，ZEB2 蛋白在宫颈癌组织中高表达率为57.14%(48/84)，显著高于其在宫颈正常对照组织中的高表达率32.50%(13/40)，差异有统计学意义(χ2=6.584，P=0.010)。见图2。

图2 IHC检测ZEB2蛋白的表达(200×)Fig.2 Expression level of ZEB2 protein detected by IHC (200×)

6 miR-25-3p与ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宫颈癌组织中表达的相关性 Pearson相关分析显示，miR-25-3p与ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宫颈癌组织中的表达呈负相关(r=-0.671，P=0.000；r=-0.592，P=0.000)。见图3。

图3 宫颈癌组织中miR-25-3p和ZEB2相对表达的相关数据散点图(n=84)Fig.3 Scatter diagram of relative expression of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer (n=84)

7 miR-25-3p对ZEB2的靶向调控作用 Target Scan7.1软件在线预测显示ZEB2的3’UTR区与miR-25-3p具有结合位点。双荧光素酶报道基因试验结果显示，与NC + ZEB2-wt共转染组相比，miR-25-3p + ZEB2-wt共转染组的荧光素酶活性降低(P＜0.05)，而NC + ZEB2-mut和miR-25-3p +ZEB2-mut组间的荧光素酶活性无统计学差异(P＞0.05)。见表3。

表3 各组荧光素酶活性Tab. 3 Luciferase activity in each group

8 qRT-PCR检测miR-25-3p mimic和ZEB2过表达质粒转染效果 qRT-PCR检测结果显示，NC组和miR-25-3p mimic组细胞中miR-25-3p的表达分别为1.03±0.04和6.54±1.29，与NC组相比，miR-25-3p mimic组细胞中miR-25-3p表达显著增加(t=7.395，P=0.002)，miR-25-3p mimic成功转染宫颈癌HeLa细胞。NC组、miR-25-3p mimic组和miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞中ZEB2的表达分别为1.04±0.03、0.52±0.14和0.73±0.08，与NC组相比，miR-25-3p mimic组细胞中ZEB2的表达显著降低(LDS-t=6.726，P=0.001)，表明miR-25-3p负调控ZEB2的表达。与miR-25-3p mimic组相比，miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞中ZEB2的表达显著增加(LDS-t=2.716，P=0.035)，表明ZEB2过表达质粒成功转染宫颈癌HeLa细胞。见图4。

图4 miR-25-3p与ZEB2启动子区结合位点Fig.4 Binding sites of miR-25-3p and ZEB2 promoter region

9 MTS检测miR-25-3p靶向ZEB2对宫颈癌细胞增殖能力的影响 MTS实验结果显示，与NC组相比，miR-25-3p mimic组和miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞增殖能力显著降低(P＜0.05)；与miR-25-3p mimic组相比，miR-25-3p + oe-ZEB2组细胞增殖能力显著增加(P＜0.05)。见图5。

图5 MTS实验检测miR-25-3p靶向ZEB2对宫颈癌细胞增殖能力的影响 (aP＜0.05，vs NC组；bP＜0.05， vs miR-25-3p mimic组)Fig.5 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the proliferation of cervical cancer cells detected by MTS test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

10 Boyden实验检测miR-25-3p靶向ZEB2对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 Boyden实验结果显示，与NC组相比，miR-25-3p mimic组和miR-25-3p+oe-ZEB2组细胞侵袭能力显著降低(P＜0.05)；与miR-25-3p mimic组相比，miR-25-3p+oe-ZEB2组细胞侵袭能力显著增加(P＜0.05)。见图6、图7。

图6 Boyden实验检测miR-25-3p靶向ZEB2对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 (aP＜0.05，vs NC组；bP＜0.05，vs miR-25-3p mimic组)Fig.6 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

图7 Boyden实验检测宫颈癌细胞侵袭能力Fig.7 The invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test

讨 论

miRNA属于一类小的内源性非编码RNA，长度为21 ～ 24个核苷酸，其在一系列肿瘤恶性生物学过程中发挥重要作用，包括肿瘤增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭[11-12]。miR-25-3p是位于染色体7q22.1上MCM7癌基因的内含子13的簇成员，其表达失调可导致包括恶性肿瘤在内的多种疾病的发生发展[13]。研究报道miR-25-3p依据不同的肿瘤类型可发挥癌因子和抑癌因子。miR-25-3p的过表达显著促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[4]。miR-25-3p上调促进了骨肉瘤细胞的生长、侵袭和耐药性，并且骨肉瘤组织中miR-25-3p的高表达与患者临床预后呈负相关[14]。而卢沐[6]报道miR-25-3p抑制食管癌细胞增殖和侵袭能力。已有研究报道在宫颈癌顺铂耐药细胞中miR-25-3p表达降低，miR-25-3p的异位表达逆转了EMT表型并促使宫颈癌细胞对顺铂敏感度增加[7]。而miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达及作用未知，本文采用qRT-PCR检测发现miR-25-3p在84例宫颈癌组织中的表达显著低于在40例宫颈对照组织中的表达水平，并且miR-25-3p的表达水平与宫颈癌患者淋巴结转移、肌层浸润深度和FIGO分期显著相关。表明miR-25-3p表达降低参与宫颈癌的发生发展。此外，生存分析显示miR-25-3p低表达的宫颈癌患者预后较差，提示miR-25-3p可能是宫颈癌患者预后标志物。

在既往研究中，miR-25-3p在肿瘤中通过靶向BTG2和NOTCH1等基因发挥作用[4-6]。通过与靶基因的启动子区结合而负调控靶基因的表达是miRNA发挥生物学功能的作用机制[10]。Target Scan7.1生物学信息软件预测及双荧光素酶报告基因结果显示ZEB2基因是miR-25-3p的直接靶基因。本文采用qRT-PCR检测发现ZEB2 mRNA和蛋白在84例宫颈癌组织中的表达显著高于在40例宫颈对照组织中的表达水平，并且ZEB2 mRNA和蛋白与miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达呈负相关。ZEB2是由位于人的染色体2上Zfhx1 B基因编码的蛋白质分子，其中间结构是可变区，每侧有两个独立且高度保守的锌指簇[15]。ZEB2最重要的功能是参与EMT，即诱导肿瘤细胞转化为具有高侵袭性和迁移能力的间充质表型，从而导致间充质标志物(N-钙黏着蛋白和波形蛋白)的获得以及上皮标记物(E-钙黏着蛋白)的丢失[16]。Ye等[9]研究发现ZEB2在宫颈癌组织中过表达，与我们的研究一致，并且他们研究发现ZEB2在宫颈癌组织中与miR-377的表达水平呈负相关，是miR-377的靶基因。同时本文分析发现ZEB2 mRNA和蛋白表达水平与宫颈癌的组织学分级、淋巴结转移和FIGO分期相关。本文采用生存分析显示ZEB2 mRNA和蛋白高表达的宫颈癌患者预后较差，提示ZEB2可能是宫颈癌患者预后标志物。miR-25-3p是否通过负调控其靶基因ZEB2参与宫颈癌的恶性进展，本文在细胞水平进行了功能学实验，结果显示miR-25-3p显著抑制了宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力，但ZEB2可以逆转miR-25-3p在宫颈癌中发挥的抑癌作用，因此miR-25-3p是通过负调控ZEB2抑制宫颈癌细胞的恶性进展。

综上所述，miR-25-3p在宫颈癌组织中低表达，ZEB2 mRNA和蛋白在宫颈癌组织中高表达，两者的表达水平在宫颈癌中呈负相关，miR-25-3p是靶向负调控ZEB2抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力，miR-25-3p和ZEB2可能是治疗宫颈癌的潜在靶点和预后标志物。