中医药干预治疗椎间盘退行性变基因学研究进展

张立存 赵继荣 徐兵 陈祁青 赵宁 马同 张天龙 蔡毅 李玮农 杨涛

(1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 700030 ；2甘肃省中医院)

伴随老龄化人口的不断增加，人们生活质量的不断提升，一些退变性疾患如脊柱、骨关节退变的防治成为临床骨科研究的热点〔1〕。椎间盘退行性变(IDD)是多种因素综合影响的结果，其发病机制极其复杂，现有相关研究认为椎间盘组织脱水、细胞外基质降解、蛋白多糖含量下降、胶原类型转变及纤维环外层破裂等为IDD发生发展的主要原因〔2〕。临床上IDD是造成颈肩腰腿痛主要因素之一，有研究指出全球约80%的人一生经受腰腿痛折磨，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会造成了极大的负担〔3，4〕。早期观点认为IDD是由于随着年龄增大椎间盘衰老引发，然而近年来IDD的发病多呈现年轻化的趋势〔5〕。因此，明确IDD的发病机制并寻求科学有效的治疗手段是当前的主要研究方向。基于基因多态性研究基础发现，大量IDD的椎间盘组织中存在着众多基因的表达异常〔6〕。因此，IDD的发生发展可能与多种基因异常表达关系密切，且IDD的发生发展可能通过基因表达异常而诱导椎间盘细胞内信号通路和靶点发生特异性改变。中医药可直接或间接参与IDD的部分相关基因水平表达，抑制或激活相关基因表达从而达到延缓或加速IDD的发生发展。故从相关基因表达入手研究IDD的发病机制并利用中医药进行早期干预。

1 退变纤维环差异基因表达相关研究

纤维环是构成椎间盘的重要结构之一，在维持脊柱生物力学稳定、负重等方面具有重要作用。Gruber等〔7〕利用激光捕获显微切割术对椎间盘突出症受试患者纤维环细胞进行了获取并对相关基因表达做了研究，结果显示有47个差异性表达基因，与正常组相比，有 13个上调基因，19个下调基因，变性过程中受到显著调节的基因包括细胞衰老、缺氧等相关基因。其中生长停滞特异(GAS)1基因和赖氨酰氧化酶样(LOXL)2基因两种基因的表达上调最显著。GAS-1是一种主要参与细胞融合和生长抑制过程的多效性膜蛋白，能够诱导细胞增殖、停滞和凋亡，在年龄较大的小鼠骨骼肌干细胞中呈现高表达〔8，9〕。LOXL2是赖氨酰氧化酶(LOX)基因家族的成员，是一种能够通过催化肽基赖氨酸氧化为氨基己二酸半醛来启动胶原蛋白和弹性蛋白交联反应的细胞外铜依赖性酶，在衰老退化的鼠胆管上皮细胞中呈现高表达〔10，11〕。由此表明GAS1和LOXL2可能是椎间盘纤维环细胞退变的特异表达基因。Kazezian等〔12〕分析人体退化纤维环细胞，发现238个差异表达基因中有17种表达显著，其中10个上调基因，7个下调基因，差异表达基因涉及细胞增殖和炎症应答相关基因，四肽重复蛋白(IFIT)3和胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)3是明显上调的两种基因。 IGFBP3和IFIT3可以促进细胞凋亡和抑制细胞增殖，参与炎性细胞因子干扰素α信号传导途径从而使得纤维环发生退化〔13〕。叶冬平等〔14〕通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测人正常和退变纤维环细胞相关基因表达，结果显示退变纤维环细胞中转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-1、血小板源性生长因子(PDGF)和IGF-1mRNA表达量降低，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、骨形态发生蛋白(BMP)-14和胶原Ⅰ型(COL1)A1 mRNA表达升量高，表皮生长因子(EGF)mRNA在正常纤维环细胞表达阴性，而在退变纤维环细胞中有表达。上述研究表明纤维环退变涉及多种基因的参与，因此针对纤维环退变相关性基因逐个击破，有的放矢，才能从根本上防止纤维环退变。

2 退变髓核差异基因表达相关研究

髓核组织处于椎间盘的中心位置，其细胞变性及活性下降是IDD发生的主要原因，髓核组织的退变往往是IDD的开端〔15〕。在相关动物模型试验研究中，Hideki等〔16〕通过建立大鼠髓核细胞饥饿模型，检测发现差异表达的基因高达2 922个，其中表达显著的有影响细胞周期进程的生长阻滞和DNA损伤基因(Gadd)45和Tp53相关基因，p27Kip1，p21Cip1蛋白表达也有所上调。p27Kip1和p21Cip1属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)家族成员，主要在养分受限的细胞中高表达，其上调可以妨碍细胞周期，使细胞DNA更容易受到损伤〔17〕。Minogue等〔18〕通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)在分离的牛髓核细胞上发现了许多差异表达基因单元并和正常人髓核细胞及退化的髓核细胞进行比较，发现11个基因〔突触小体相关蛋白25 kD(SNAP-25)、细胞角蛋白(KRT)8、 KRT18、 KRT19、钙黏着蛋白(CDH)-2、骨涎蛋白(IBSP)、多功能蛋白聚糖基因(VCAN)、腱调蛋白 (TNMD)、脑富含膜附着信号蛋白(BASP)1、叉头框F1基因(FOXF1)、腓骨蛋白(FBLN)1〕在人正常髓核细胞中也存在差异表达，但不显著，4个基因(SNAP25，KRT8，KRT18和CDH2)的表达在人退变髓核细胞显著下调。尽管该实验存在种间差异，但是这种基因表达特征将有益于组织工程研究。Shao等〔19〕使用qRT-PCR技术检测钙化髓核的差异表达基因，检测结果发现了132个差异表达基因，其中上调基因129个，下调基因3个。显著上调基因中前6个为硬化蛋白(SOST)，多聚IgA和IgM的连接链，防御素α4(DEFA4)，人分泌型卷曲蛋白(SFRP)4，蛋白酶(PRTN)3和组织蛋白酶(CTS)G，其中SOST和SFRP4的上调与Wnt信号通路的抑制相关。该研究证明了椎间盘钙化可能与Wnt通路异常和炎症相关因子高表达相关。Leung等〔20〕通过研究BMP在人体髓核细胞中的作用并比较BMP-7与BMP-2对髓核细胞表型和功能活性的影响，发现在退化的髓核细胞中BMP表达比非退化细胞中整体弱，相比于BMP-2、BMP-7可以诱发丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)1使得退变髓核细胞中高表达的EP300基因发生变化，另外还可以抑制纤维化基因的表达进而延缓髓核退变。这一发现表明BMP在分子层面防治IDD意义重大。Wan等〔21〕采用基因芯片分析技术研究人髓核中长链非编码RNA(lncRNA)的表达，结果发现116个差异表达lncRNA，其中上调67个，下调49个，该研究还发现参与细胞凋亡调控的Fas相关蛋白因子(FAF)1在退变的髓核组织中高表达。

3 退变软骨终板差异基因表达相关研究

椎间盘作为人体最大无血管组织，其营养来源主要依靠上下软骨终板扩散相邻椎骨血管内物质，有研究发现封闭终板营养途径会导致IDD的发生〔22〕。因此软骨终板的退变会使椎间盘唯一的营养通道被阻断同时代谢物质在椎间盘内积聚从而加速IDD的发生发展。低氧状态是造成软骨终板退变的重要因素，Yao等〔23〕在生理缺氧的微环境中培养并分析了人体软骨终板间充质干细胞，发现448个差异表达基因，其中上调330个，下调118个，与正常氧组相比，低氧组IL-1受体相关激酶(IRAK)3和补体因子(CF)D显著上调。相反，3个基因(转铁蛋白受体，磷酸甘油酸突变酶2和钙蛋白酶6)的表达显著低于正常氧组。表明缺氧状态炎症相关因子基因高表达是软骨终板退变的主要原因。Xiao等〔24〕在人体退变的软骨终板细胞中发现环状RNA-0058097(circRNA-0058097)高表达，进一步研究其机制得出 circRNA-0058097是一种对机械张力敏感的非编码RNA，其可以靶向miR365a5p来上调组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)4基因表达，从而促进终板软骨细胞变性。HDAC4是组蛋白脱乙酰基酶家族的成员，它可以通过调节核小体的结构和抑制转录因子的活性来控制细胞增殖和分化，是软骨细胞分化和变性的重要调节剂〔25〕。这项研究表明circRNA-0058097-miR365a5p-HDAC4调节途径在机械张力诱导的终板软骨细胞变性中起重要作用。Zhang等〔26〕证实了变性软骨终板中细胞数量和蛋白聚糖减少，退变软骨终板中基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β的mRNA表达显著升高。软骨终板的主要成分是Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，有研究表明MMP的过表达会促使软骨终板中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解，IL-1又可以刺激MMP表达〔27〕。由此可以认为MMP-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β可能在软骨终板变性过程中发挥作用。此外，Marfia 等〔28〕发现在退变软骨终板细胞中骨桥蛋白(OPN)的基因表达显著增加(超过400倍)。OPN涉及骨基质钙化和细胞外基质破坏，该研究证明了OPN的异常表达在IDD的病理生理过程中起关键作用。以上相关研究的结论及成果对明确软骨终板退变差异表达基因意义重大，对揭示IDD的机制同样具有重要的作用。

4 中医药干预对IDD相关基因表达的影响研究

整体审查和辨证论治是中医药治疗退变性疾患最根本特征。中医学认为IDD的发病主要以肝肾亏虚为内因，风寒湿痹为外因，气滞血瘀为病理基础，故治疗指导思想以补益肝肾、祛风除湿、行气活血为主〔29〕。Trinh等〔30〕认为中医药治疗IDD疾患疗效确切。中医药治疗IDD疾患相关分子研究已取得了一定成就。

4.1中药药物对IDD相关基因表达的影响 防治IDD的中药及复方大都以补肝肾，强筋骨类为主。董晤讯〔31〕研究发现，淫羊藿苷可以明显降低髓核细胞中炎性因子IL-1β、IL-6的表达，同时上调细胞外基质Aggrecan和Ⅱ型胶原蛋白(CoL-Ⅱ)表达水平从而减轻IDD。杜仲为骨伤科常用药，常用于脊柱疾患的治疗。Yang等〔32〕研究发现杜仲可以改善人体椎间盘髓核细胞中IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)诱导的细胞外基质降解。进一步研究其作用机制后发现杜仲通过调节miR140-CREB1轴改变MMP-3，血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(ADAMTS)5和CoL-Ⅱ的表达，IL-1和TNF刺激可抑制miR140的表达，而杜仲可激活miR140的表达同时抑制IL-1和TNF等炎性因子相关基因的表达，miR140的高表达使得MMP-3和ADAMTS5蛋白表达下调同时增加CoL-Ⅱ含量来保护髓核细胞。Zhou等〔33〕发现乌头有效成分Karacoline可通过抑制NF-κB途径降低IDD中MMP-14的表达，同时增加CoL-Ⅱ和蛋白聚糖的表达。何坚等〔34〕发现葛根素可以上调IL-1β诱导的椎间盘纤维环细胞中抗凋亡因子B细胞淋巴瘤(Bcl)-2，下调促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表达来抑制纤维环细胞的凋亡。川芎嗪可通过降低终板软骨细胞中CoL-Ⅰ，碱性磷酸酶(ALP)，Runt相关转录因子(Runx)2和TGF-β1 mRNA的表达来减轻软骨终板退变〔35〕。除了单味中药，中药复方对IDD疗效亦佳，Zhu等〔36〕发现补肾活血方可以通过Wnt/β-catenin通路上调miR-483-3p和GSK3B的表达，抑制miR-23c和CTNNB1表达，从而调节退变椎间盘中髓核细胞增殖、细胞外基质重塑和调控终板软骨细胞来延缓IDD。另外，白荣飞〔37〕的研究表明补肾壮督方可上调Bcl-2的表达，下调caspase-3的表达，从而延缓IDD。六味地黄丸治疗IDD的相关分子研究中表明其能上调IDD模型中糖胺多糖含量、透明质酸含量、硫酸软骨素/硫酸角质素比例，增加IDD模型中CoL-Ⅱ mRNA的表达，降低CoL-Ⅰ mRNA的表达，从而在一定程度上减缓IDD〔38〕。

4.2中医非药物疗法对IDD相关基因表达的影响 除中草药外，针灸、推拿按摩、针刀等均是中医治疗疾病的特色手段。杨宗保等〔39〕研究发现通过电针IDD模型兔环跳穴可降低其髓核细胞中炎性因子前列腺素(PG)E2、磷脂酶(PL)A2和IL-1α的表达。林元杰〔40〕通过针刺IDD大鼠模型肾俞、大肠俞、环跳、阳陵泉发现其可通过脊髓Janus激酶(JAK)2-信号传导及转录激活因子(STAT)3信号通路下调p-JAK2、p-STAT3蛋白含量的表达来延缓IDD。佟思琪等〔41〕探讨电针夹脊穴对IDD兔模型椎间盘组织中终板软骨细胞水通道蛋白(AQP)1和3基因表达的影响发现其通过上调蛋白激酶(PK)A-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的表达水平，继而增加AQP1、3 mRNA的转录，促进椎间盘 AQP1、3 蛋白的表达来延缓IDD。王伟军〔42〕通过手法按摩与MMPs抑制剂治疗IDD进行了比对研究，结果表明中医手法在抑制IDD相关基因Col-1a、MMP-3表达，增加椎间盘保护性基因Col-2a、TIMP-1的表达与MMPs抑制剂四环素作用相当，而中医手法按摩在上调稳定细胞外基质延缓IDD相关基因Aggrecan、转化生长因了(TGF)-β1、VDR的表达量较四环素更明显。可见中医按摩手法对调节IDD相关基因的表达延缓IDD的治疗效果比四环素更显著。此外，有研究表明痛点揉拨推拿手法可使IDD患者的IL-1β表达水平显著降低达到抑制炎症反应的作用〔43〕。Sun等〔44〕研究结果表明针刀治疗通过调节细胞外基质的胶原蛋白含量，增加CoL-Ⅰ的产生和减少CoL-Ⅱ生成，同时改进椎间盘超微结构来抑制IDD。

综上，中医药防治脊柱退变性疾患经过上千年的传承与发展，在认识和治疗脊柱退变性疾患方面有着丰富的理论基础和实践经验，随着中医药基础研究、基因蛋白组学、基因芯片等现代科技的蓬勃发展，对IDD的发病机制研究从生物分子学、基因表达水平相关方面创造了新的研究平台，也为中医药精准靶向防治IDD的研究提供了理论依据，支撑中医药防治IDD相关疾病不断取得突破，造福广大患者。但中医药治疗IDD疾患的分子生物学研究大都局限于基础实验研究，具体试验方法设计或多或少存在缺陷、调控过程和级联方式仍未具体有效阐明、相关信号通路研究不够深入。目前仍需要大样本，多中心的随机对照实验提供更科学、更准确、更客观的依据进行佐证。因此，借助现代科学技术深入研究中医药靶向治疗IDD及相关疾患的相关研究将是今后努力方向之一。