基于津液理论探讨改良枳术方对便秘大鼠AQP3/AQP9、MUC2的影响＊

闻 永，占 煜，魏先鹏，唐学贵＊＊

（1.西南医科大学附属医院 泸州 646000；2.成都中医药大学临床医学院 成都 610000；3.成都市中西医结合医院 成都 610000；4.川北医学院附属医院 南充 637000）

便秘是一种常见的胃肠道疾病，也是多种疾病的常见症状，其中以慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)临床较为常见。便秘不仅诱发肛周疾病，严重影响生活质量，同时与心脑血管意外等致死致残性疾病密切相关[1-2]。因此便秘的有效防治至关重要。但慢性便秘的机制尚不明确，目前认为可能与以下因素相关：遗传、生活方式、心理行为因素、肠道运动功能等，发病机制研究多集中于肠神经系统、Cajal间质细胞、肠神经递质、结肠平滑肌、肠道菌群以及microRNA、孕酮、甲烷、水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)等[3]，目前尚无普遍的共识。因此导致了现有的便秘治疗手段以对症治疗为主，远期疗效差，而手术治疗也存在创伤大，疗效不确切的风险，急需一种安全有效的便秘治疗方法。

中医药作为我国特色医疗资源宝库，在慢性便秘防治中优势明显，但是缺乏系统的理论和作用机制研究，限制了其临床推广应用。课题组在长期临床实践的基础上，提出从脾论治便秘，筛选出经典名方枳术丸，并适当化裁为改良枳术方，临床应用取得良好疗效[4]，其作用机制可能与调控结肠AQPs影响结肠水分代谢相关[5-6]。在此基础上我们在“大肠主津”理论下进一步明确了AQP3/AQP9介导的结肠水分代谢在便秘发生中的重要作用。近期胃肠道粘液层功能受到广泛关注，其与炎症免疫，肠道动力障碍等关系密切[7-8]。已有研究证实，黏蛋白2(Mucin 2，MUC2)表达降低，肠道粘液的减少与便秘发生密切相关[9]。受此启发，我们以中医传统津液理论为指导，结合津液既有相同又有不同的特点，创新性提出结肠AQP3/AQP9、MUC2介导的结肠水分和粘液与中医学的“津”“液”相吻合，两者的代谢异常可能与便秘发生密切相关，而改良枳术方正是通过调控津液代谢异常发挥通便作用，因此本研究作为课题的一部分，拟使用改良枳术方干预STC模型大鼠，观察大鼠结肠AQP3/AQP9、MUC2表达的变化，以进一步明确改良枳术方的作用机制，扩展津液理论现代诠释。

1 材料与方法

清洁级Wistar大鼠48只，雄性，体质量230±30 g，由川北医学院实验动物中心提供和饲养，川北医学院实验动物使用许可证号：SYXK(川)2018-076。饲养条件：独立饲养，饲养环境室温(24±2℃)、55±5%湿度、明暗各12 h(人工照明：08:00-20:00)、24 h自由饮水、噪音＜60 dB，饲料、垫料均来自川北医学院实验动物中心。

1.2 药品

改良枳术方免煎颗粒配方枳实、白术药物来源于川北医学院附属医院药房，江阴天江药业有限公司生产；盐酸洛哌丁胺胶囊(西安杨森制药有限公司，国药准字：H10910085)；枸橼酸莫沙必利分散片(成都康弘药业集团股份有限公司，国药准字：H20031110)。

1.3 主要试剂及仪器

多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；二甲苯(成都科龙化工试剂厂)；苏木素(北京百灵威科技有限公司)；柠檬酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio);MUC2兔单克隆抗体(ABcam公司)；AQP9兔多克隆抗体(Affinity)；AQP3兔多克隆抗体(ABcam公司)；生物素二抗山羊抗鼠/兔工作液(北京中杉金桥生物有限公司);正常山羊血清(北京中杉金桥生物有限公司);浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。

转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)等；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)；化学发光凝胶成像仪5200(上海天能科技有限公司)。

1.4 模型制备

使用洛哌丁胺灌胃制备慢传输便秘模型，参照课题组既往及其他文献[10-11]，配制1 mg/mL洛哌丁胺混悬液，按10.0 mg/kg的剂量灌胃，bid，连续30天，空白组予等量蒸馏水灌胃。造模期间予大鼠正常进食饮水。除空白组外，其余各组均给予洛哌丁胺建立慢传输型便秘大鼠模型。以粪便含水量、肠道转运时间验证造模是否成功。

1.5 分组及给药

将48只大鼠按照随机数字表法随机分为6组，即：空白组，模型组，莫沙必利组、改良枳术方低、中、高剂量组，造模成功后，各治疗组分别给予相应药物灌胃治疗。其中改良枳术方以枳实15 g、白术30 g为低剂量、枳实15 g、白术60 g为中剂量、枳实15 g、白术90 g为高剂量，按照人与动物剂量换算，低、中、高剂量组大鼠分别给予4.725、7.875、11.024 g/(kg·d)灌胃，莫沙必利组以1.56 mg/(kg·d)莫沙必利混悬液灌胃，空白组和模型组灌胃等剂量的蒸馏水。每天一次，共持续7天。

1.6 观察指标及方法

1.6.1粪便含水量及24 h排便粒数

造模结束(即最后一次洛哌丁胺灌胃)后，分别将大鼠放入代谢笼中，收集每组大鼠24 h粪便并计数，然后用电子天平分别称其重量为湿重(W1)，后置于60℃温箱中干燥12 h后称其干重(W2)，按下面公式计算大便含水量百分比：粪便含水量＝[(W1-W2)/W1]x100%。

1.6.2肠道转运时间

每组随机选择3只大鼠进行肠道转运时间测定。造模结束后3只大鼠用预先准备好的10%的活性炭2 mL灌胃，记录每只大鼠灌胃时间，每只大鼠单独放入代谢笼中，然后观察并记录每只大鼠第一粒黑便排出时间，从灌胃至第一颗黑便排出时间即为肠道转运时间。

1.6.3肠道推进率

各组大鼠处死前，随机选择3只大鼠，予以禁食禁水24 h后，以配制好的10%活性炭混悬液10 mL/kg灌胃，30 min后，用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死，打开腹腔，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部全部肠管，轻拉呈直线，静置30 s，测量应在无张力情况下完成，测量肠管长度为肠管总长度L1及从幽门至炭末前沿的距离L2。肠道推进率=(L2/L1)x100%。

1.6.4免疫组化检测结肠AQP3、AQP9、MUC2表达

用配制好的2%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射进行麻醉，待麻醉效果满意后,采取颈椎脱臼法处死大鼠，剪开腹部，取出结肠，切取远端结肠约2 cm，用PBS缓冲液涮洗，4%多聚甲醛固定液固定后备用。

固定组织经全自动脱水机脱水，包埋，切片、烤片、脱蜡后，将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，微波炉中高火加热至沸腾后断电，间隔5 min后，反复1次，冷却后，PBS洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封闭液，室温20 min；滴加一抗(AQP3、AQP9、MUC2)，4℃过夜；滴加生物素化二抗，37℃30 min；PBS水洗3次，每次5 min；使用DAB显色试剂盒，混匀试剂后滴加到切片上，室温显色，镜下控制反映时间，2 min左右，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再选取3个视野分别采集400倍显微图像。

1.6.5蛋白免疫印迹法检测结肠AQP3、AQP9、MUC2表达

蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)简要操作步骤：使用RIPA裂解液将结肠组织裂解30 min，然后离心在4℃下以12000 r/min转速运行10 min后取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书步骤进行。随后蛋白变性、上样、电泳、转模，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，TBST洗膜3次，加入一抗、二抗进行孵育，相关蛋白的表达通过增强化学发光检测试剂盒使用凝胶成像仪进行可视化，用天能GIS机箱控制软件V2.0对条带进行曝光扫描，结果以目的蛋白相对表达量表示(目的蛋白IOD/内参IOD)。

1.7 统计方法

采用统计软件SPSS22.0处理分析，计量资料都以均数±标准差(xˉ±s)表示，多组间比较符合正态分布及方差齐性的采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD检验，方差不齐，采用Dunnett’sT3检验。P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 大鼠一般情况

各组大鼠实验前均精神良好，活动敏捷，皮毛光泽，进食进水量正常，排便频次正常，大便干湿适中。本次实验过程中共死亡大鼠5只，除了低剂量组外，其他组分别死亡1只。死亡大鼠中2只在开始灌胃的当天死亡，剩下3只在第2天死亡，尸检时均发现肺部有血性分泌物，肺组织损伤严重，考虑可能是灌胃操作时大鼠固定不佳，手法不当损伤肺部导致死亡，及时总结经验，后续未见大鼠死亡。实验开始后空白组大鼠体质量逐渐增加，精神状态佳，粪便呈连续条状。其余分组大鼠约在造模开始第7天前后开始出现不同程度的变化：皮毛泛黄、光泽差，精神较前差，进食饮水减少，大便量少，粪便干硬，成颗粒状。治疗结束后，各治疗组大鼠，包括模型组大鼠一般情况均有不同程度的改善，大便和进食饮水情况也有所改善。

2.2 各组大鼠大便粪便含水量及24 h粪便颗粒数比较

各组大鼠大便粪便含水量及24 h粪便颗粒数如表1示，与空白组比，其他各组造模后粪便含水量及24 h排便粒数均明显减少(P＜0.05)。表明洛哌丁胺造模后大便干结，排便减少，符合便秘表现，便秘模型成功；与模型组比，各组治疗后粪便含水量及24 h粪便颗粒数均明显增加(P＜0.05)，在莫沙必利与中药干预各组的比较中，高剂量组和中剂量组干预后的粪便含水量明显高于莫沙必利组(P＜0.05)，表明经过治疗后各组大鼠的便秘症状均得到缓解，大便变软，排便量增加，其中改良枳术方的中高剂量的临床疗效优于莫沙必利组，特别是在增加粪便含水量方面；各干预组中24小时粪便颗粒数未见显著差异(P＞0.05)，表明改良枳术方和莫沙必利在增加排便量方面疗效相当。

表1 24 h粪便颗粒数和粪便含水量

2.3 各组大鼠肠道转运时间和肠道推进率比较

各组大鼠肠道转运时间和肠道推进率如表2示，与空白组比，造模后肠道转运时间明显延长(P＜0.05)，表明便秘模型大鼠肠道转运缓慢，符合慢传输便秘的病理，造模成功；与模型组比，干预后各组肠道推进率明显增加(P＜0.05)，与莫沙必利组比，各中药干预组肠道推进率增加不显著(P＞0.05)，表明经过无论是中药还是西药的干预，便秘大鼠的肠道运动功能均明显恢复，但改良枳术方未能显示出比莫沙必利更强的促进肠道运动能力。

表2 肠道转运时间和肠道推进率

2.4 结肠组织AQP3、AQP9和MUC2免疫组化表达比较

各组大鼠结肠组织AQP3、AQP9和MUC2表达如表3及图1示，与空白组相比，模型组大鼠肠组织MUC2蛋白含量明显降低，AQP3蛋白含量明显升高(P＜0.05)，表明便秘大鼠的结肠MUC2蛋白生成降低，结肠粘液减少；AQP3蛋白增加，结肠水分重吸收增多，造成肠道内水分不足，这可能是便秘发生的机制之一；与模型组相比，高剂量组、中剂量组大鼠肠组织MUC2蛋白含量均升高(P＜0.05)，提示改良枳术方可以促进肠道黏蛋白2的生成，增厚肠道粘液层；莫沙必利组、高剂量组、中剂量组大鼠肠组织AQP3蛋白含量均降低(P＜0.05)，高剂量组大鼠肠组织AQP9蛋白含量降低(P＜0.05)，提示改良枳术方可能通过减少AQP3、AQP9的表达，抑制其水分重吸收功能，增加肠道水分从而发挥通便作用。

图1 各组大鼠结肠组织AQP3、AQP9、MUC2蛋白表达结果(×400)

表3 大鼠肠组织AQP3、AQP9、MUC2平均光密度(xˉ±SD)

2.5 结 肠 组 织AQP3、AQP9和MUC2蛋 白WB检 测比较

各组大鼠结肠组织AQP3、AQP9和MUC2蛋白表达经WB检测，结果如图2示，与免疫组化结果基本一致。与空白组相比，模型组大鼠肠组织MUC2含量明显降低，AQP3含量明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，各干预组大鼠结肠组织MUC2含量均升高（P＜0.05），AQP3含量均降低（P＜0.05），高剂量组大鼠结肠组织AQP9含量降低（P＜0.05）。提示改良枳术方可能通过减少AQP3、AQP9的表达，增加肠道水分，同时促进肠道MUC2的生成，增加肠道黏液分泌从而发挥通便作用。

图2 Western blot检测大鼠结肠组织AQP3、AQP9、MUC2蛋白表达水平

3 讨论

便秘的症状主要有自发性排便次数减少和大便的干结，也包括排便困难如排便费力、排便不尽感、肛门直肠堵塞感、排便费时等一系列症状。本实验中使用洛哌丁胺造模后大鼠出现大便干结，粪便含水量减少，排便量少，肠道转运时间延长，符合便秘临床表现，造模成功。

AQPs是一类具有特异孔道结构的跨膜蛋白，也称水孔蛋白，主要介导水分子和甘油分子的通透。AQPs广泛存在于动植物和人体的各种组织、细胞中，尤其与液体吸收和分泌有关的上皮和内皮细胞，参与调节液体吸收、分泌和细胞内外水平衡等与水跨膜转运有关的生理和病理过程。因此近来不断有报道发现STC发生与结肠AQPs的异常表达有关。我们前期研究发现结肠AQP3主要介导近端结肠的水分重吸收，AQP9主要介导远端结肠水分重吸收，两者所介导的肠道水分重吸收功能失常，与便秘的发生密切相关[12-13]。本研究中也发现便秘模型大鼠结肠AQP3表达明显增加，从而导致结肠水分被重吸收过度，粪便含水量减少，诱发便秘发生。

MUC2是肠道黏液层所有粘蛋白中最重要的黏液蛋白蛋白质，已被证明是一种重要的对外源性病原体的保护屏障，在肠道内稳态方面具有多种功能。MUC2同时作为保护粘膜的润滑剂也可以协助粪团通过。MUC2减少和(或)黏液层厚度降低也可见于便秘患者。一项针对药物性便秘大鼠的研究表明，黏液层厚度减少，可能阻碍大便通过[14]。在对洛哌丁胺诱发的便秘大鼠模型的研究表明，使用硫酸多糖诱导肠道运动能够增加肠上皮粘蛋白(MUC2)的产生和粘液层的厚度，从而增加了粪便排泄。有研究发现补充复合益生菌可能通过上调MUC2基因，促进黏蛋白分泌达到有效改善排便频率及性状，缓解便秘症状的效果[15]。另外将STC患者的粪便菌群植入伪无菌小鼠可诱导后者产生STC症状，且伴随MUC2表达的显著下降[16]。这些均说明MUC2的表达在便秘发生发展中发挥重要作用。本研究中也可以看到便秘模型大鼠结肠MUC2明显减少，导致肠道粘液生成不足，肠道润滑不够，大便通过缓慢。

祖国医学认为慢性便秘与水液代谢失常密切相关。《伤寒论》“太阳病发汗、若下、若利小便，此亡津液，胃中干燥……不更衣，内实，大便难者”《诸病源候论》、《重订严氏济生方·秘结论治》、《兰室秘藏·大便结燥》、《景岳全书·秘结》中均明确指出津液不足是导致便秘的重要原因。“津亏肠燥、大便秘结”，导致便秘的发生。

津液因均来自水谷精微化生，共同发挥滋养濡润故两者常常一起统称，但两者仍有不同。《灵枢·决气》说：“腠理发泄，汗出溱溱，是谓津……谷入气满，淖泽注于骨，骨属屈伸，泄泽补益脑髓，皮肤润泽，是谓液”。《灵枢·五癃津液别》又说：“津液各走其道，故三焦出气，以温肌肉，充皮肤，为其津；其流而不行者，为液。”在津液中，质地较清稀，流动性较大，布散于体表皮肤、肌肉和孔窍，并能渗入血脉之内，起滋润作用的，称为津；质地较浓稠，流动性较小，灌注于骨节、脏腑、脑、髓等，起濡养作用的，称为液。《类经·藏象类》注曰：“津液本为同类，然亦有阴阳之分。盖津者，液之清者也；液者，津之浊者也。津为汗而走腠理，故为阳；液注骨而补脑髓，故属阴。”具体到肠道而言我们认为肠道内的水分清稀流动为“津”，肠道的粘液质稠濡养为“液”，肠道津液不足导致便秘发生。

结合现代医学诠释，我们大胆设想AQP3/AQP9主要调控肠道水分代谢，符合“津”的定义，而MUC2主要调控肠道黏液的生成，黏液润滑濡养，符合“液”的定义，两者共同在便秘发生发展中发挥重要作用。其他研究从津液相关性也佐证了这一观点，在顽固性便秘中结肠AQP9与MUC2在空间分布上和表达方式上均具有一致性，充分提示了二者在功能上密切相关，而中药白花蛇舌草，甘草和肉桂混合物用于治疗便秘，发现可以同时调节MUC2和AQP8[17]。在急性干眼症中AQP5和黏蛋白5AC之间存在协调反应，而甘草酸可以通过NF-κB途径同时抑制组胺介导的人鼻上皮细胞黏蛋白5AC上调和AQP5下调[18]。这些研究均提示水通道蛋白介导的水分代谢和黏蛋白介导的黏液代谢之间存在密切的关联，这也与中医津液理论的津液同源可以互补转化不谋而合。在本实验研究中也证实便秘模型组大鼠AQP3/AQP9、MUC2均有不同程度的变化，导致“津”“液”两伤，诱发便秘形成，符合津液既相互协调又各有不同的特点。

枳实白术配伍首见于《金匮要略》：“心下坚，大如盘，边如旋盘，水饮所作，枳术汤主之。”方中枳实七枚，为君药，主行气散滞；白术二两，为臣药，主健脾化饮。两者配伍，功能行气散滞，健脾化饮。刘完素《素问病机气宜保命集》记载了枳术丸，方中白术一两，枳实麸炒五钱，主治“气不下降食难消化”。李杲录存张完素创立的枳术丸，初见于《内外伤辨惑论》“易水张先生枳术丸”，《脾胃论》中更名为枳术丸。方中枳实麸炒黄去瓤一两，白术二两，“荷叶裹饭为丸……多用白汤下”，白术用量是枳实的两倍，意在健脾，消食为辅；枳实麸炒，一可增其入脾胃之功，消除积滞，二可减弱辛散峻烈之性，减少对脾胃的损伤；两药配伍，补重于消，寓消于补，补脾不滞邪，祛邪不伤正。我们将其进一步改进，结合慢性便秘虚实夹杂的病机，加强补脾之功，增加白术用量，以补为主，补通兼施，“补脾升清”恢复脾的运化功能，“行气降浊”恢复胃肠的通降功能，同时剂型由丸剂改为汤剂，缩短起效时间。实验中也可以看到改良枳术方中高剂量组对于便秘模型大鼠的24 h粪便数目、粪便含水量均有明显改善，缩短了肠道传输时间。

在作用机制上，改良枳术方一方面能够抑制AQP3、AQP9的表达，减少肠道水分的重吸收，增加肠腔内水分，使大便含水量增加，缓解便秘，这与我们既往的研究基本一致；另一方面可以提高MUC2的表达，增加结肠粘液分泌，缩短粪便通过时间从而达到改善便秘的效果，与已有的研究发现中药复方或中药提取物通过刺激结肠粘液，增加肠道黏液层厚度发挥通便作用一致[19-20]。但本研究将AQPs和MUC2一起讨论，并赋予其中医“津”“液”不同属性，对于便秘发生和中药复方作用机制的揭示有一定的价值，同时也是对中医药传统理论的现代诠释。

另外在肠道推进率和24 h粪便数目两个方面改良枳术方组与莫沙必利组相比未能显示出明显优势，可能与莫沙必利作为促动力药物，其促动力的效果相对明显，改良枳术方主要作用机制在于增加肠道水液，改良枳术方组粪便含水量方面优势明显，也佐证了这一观点。而AQP9在便秘模型组和改良枳术方中剂量组均未能呈现与AQP3相同的显著变化，猜测原因可能与AQP9在结肠水液代谢中并非发挥核心作用相关。另外在蛋白表达比较中免疫组化与WB结果在具体结果上可能稍有不同，但总体趋势未变，可能与检测方法不同有关，后续可引入其他检测方法或增大样本量来验证。

综上所述，AQP3/AQP9、MUC2介导的结肠“津”“液”代谢在便秘发生发展中发挥重要作用，改良枳术方用于便秘疗效确切，其可能的作用机制为通过调控AQP3/AQP9、MUC2从而影响结肠的“津”“液”代谢，增加肠道肠道水分，增加粘液层厚度，从而发挥通便作用。

本研究仍有不足之处和拓展的空间，在便秘形成过程中“津”“液”存在怎样的动态变化，AQPs和MUC2之间是否存在互补协调关系，改良枳术方通过何种途径调控AQP3/AQP9、MUC2表达仍需后续进一步研究。