稳定性冠心病血瘀证的血浆定量蛋白质组学探析＊

杨 光，何浩强，谌子诺，周思远，王 阶＊＊

（1.中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2.北京中医药大学中医学院 北京 100029）

冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉出现狭窄、阻塞，引起心肌缺血、缺氧的心脏病。稳定性冠心病是冠心病的慢性阶段，临床表现为间断发作的心绞痛或心肌缺血症状，威胁着患者的生活质量和远期预后[1,2]。稳定性冠心病的管理以生活方式干预，强化药物治疗和减少危险因素为主[3]。但即使经过有效管理，有些患者仍会出现心肌缺血症状。经皮冠状动脉介入治疗可降低心绞痛的发作次数，但会引起5%至10%的再狭窄风险，且难以改善心血管远期预后[4-5]。以上问题表明，冠心病需要开发新的个体化治疗策略，来改善疗效和预后。中医药通过个体化施治，能够显著降低心绞痛发作的次数和程度，并改善血栓形成相关指标和患者的生活质量[6,7]。血瘀证是冠心病的主要证候之一，也是证候生物学研究的热点领域，已经在DNA、RNA、蛋白质、代谢物等多个层面展开探索，并取得了阶段性成果，挖掘出许多与证候相关的标志物分子[8-11]。蛋白质是机体生物学功能的执行者，与中医证候具有许多相似点与联系，两者都是机体即时功能状态的反映，挖掘蛋白质组有利于从表层原因层面探究证候的微观物质基础[12]。非数据依赖性采集模式（data independent acquisition，DIA）作为一种新的谱图采集模式，将质谱的全扫描范围分为若干个窗口，然后对每个窗口中的所有离子进行检测、碎裂，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的信息。能够降低样本检测的缺失值，同时提高定量准确性和重复性[13]。有鉴于此，本研究采用DIA定量蛋白质组学技术和生物信息学方法，筛选冠心病血瘀证的特征性差异蛋白，探索其关键生物学过程，为中医证候的客观化研究与冠心病个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究中，疾病观察组纳入5例稳定性冠心病血瘀证患者，病例收集于广安门医院门诊及病房。对照组纳入5例健康成人，健康受试者来源于在校研究生，收集于2020年11月至2021年1月。稳定性冠心病诊断标准参照2018年中华医学会心血管病学分会发布的《稳定性冠心病诊断与治疗指南》，主要包括慢性稳定性型心绞痛和急性冠脉综合征之后的稳定期阶段[14]。血瘀证诊断标准参照2018年中华中医药学会发布的《冠心病心绞痛证候要素诊断标准》，证候要素得分相加≥8分即可诊断[15]。纳入标准：①符合稳定性冠心病的疾病诊断及血瘀证的证候诊断；②年龄在30-75岁之间；③自愿参加并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

血浆去高丰度蛋白试剂盒(小柱子)ThermoFisher批号85165；血浆去高丰度蛋白试剂盒(大柱子)Millipore批号 122642；SDS裂解液 碧云天 批号P0013G；BCA试剂盒ThermoScientific批号23227；磷酸 国药 批号10 015418；胰酶 华利世 批号HLS TRY001C；无水乙醇GENERALREAGENT批号G73537B；异丙醇GENERALREAGENT批号G75885B；TiO2岛津5020-75000；丙酮 沃凯 批号40 064485；iRT Biognosys批号Ki-3002-2；Q Exactive HF质谱仪ThermoFisher；台式冷冻离心机 上海卢湘仪 批号TGL-16A；酶标仪 上海科华实验系统有限公司 批号ST-360；高pH分离液相色谱仪Agilent 1100 series；96孔SPE除盐柱ThermoFisher批号60309-001。

1.3 蛋白质提取

①采集研究对象的空腹静脉血后分装于2 ml乙二胺四乙酸抗凝管内。在4℃3000 rpm/分钟条件下离心15分钟，取上清液，分装于微型离心管中。②采用白蛋白/IgG去除试剂盒去除高丰度蛋白。每个样品取40 µL血浆，用结合缓冲液十倍稀释血浆。③准备好分离柱后，加入稀释的样本，让其靠重力流过柱体，就初步实现了高丰度蛋白的去除。之后两次加入缓冲液清洗柱体。④在样本中加入300µl SDS裂解液，将溶液在室温下12000×g离心10 min，取上清，再重复离心后取上清获得样品的总蛋白溶液。

1.4 蛋白质浓度测定

①按照二辛可宁酸试剂盒说明书，根据buffer A:Buffer B=50∶1配置显色液。②取出部分待测蛋白溶液，加超纯水进行稀释。③准备一个干净的96孔板，加入如下梯度的标准蛋白溶液：0、1、2、4、8、12、16、20µg/µL，然后每个孔加入相应体积的超纯水补充体积至20µL。④将2µL待测蛋白溶液加入96孔板，每个样品设置三个复孔，同样补充体积至20 µL。⑤各孔内加入200 µL预配制的显色液，37℃反应30 min。⑥使用酶标仪进行吸光度值测定，计算标准曲线，代入待测样品的吸光度值，计算出蛋白浓度。

1.5 蛋白质酶解和肽段纯化

将蛋白样品还原并烷基化后，酶解为长度适合质谱检测的肽段，然后去除盐离子和其他杂质。①根据测定的蛋白浓度，调整不同样品到相同的浓度和体积。②在蛋白溶液中加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)，在55℃孵育30 min，还原蛋白中的双硫键。③在冰上进行冷却直到达到室温。④加入相应体积的碘乙酰胺。⑤加入丙酮沉淀蛋白。⑥4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶，并于37℃过夜。⑧加磷酸调PH值为3左右终止酶解反应。⑨用200µl甲醇活化96孔SPE除盐柱，上样，调节真空和液滴速度。⑩用甲醇清洗2次，最终得到干燥的肽段。

1.6 LC-MS/MS高分辨质谱检测

质谱进样前，每个样品按照标准品:待测样品=1∶10的体积比混合，作为内标。首先是液相分离，将所有酶解后的样本取等量肽段混合，使用Agilent 1100 HPLC系统，在pH=10的流动相中进行组分分离。其次是质谱分离，高压泵将存储环中的液体推入与质谱相连的分析柱中，流速为1 uL/min，采用30SPD方法进行分离。离子源将肽段转化为肽段离子，采集肽段离子的一级谱图，并根据质核比(m/z)筛选用于二级质谱检测的肽段，最终形成二级谱图

1.7 数据解析

质谱输出的谱图，用理论谱图进行匹配。使用Spectronaut Pulsar软件进行搜库与鉴定。

1.8 差异蛋白表达分析

利用数据库检索得到原始数据，进行数据的预处理。若某一蛋白质的缺失值占比≥50%，则将此蛋白质数据剔除。缺失值≤50%的蛋白用同组样本均值填充缺失值，经Median Normalization及log2对数转换，得到可信蛋白数据。不同组别中的可信蛋白平均值相减，得到log2FC。由log2FC可以反推得到差异倍数（FC,fold change）。采用Excel的t.test公式计算p.value。计算FC阈值在1.5水平下的差异蛋白质表达情况，并通过R语言的Ggplot2包绘制火山图进行可视化展示。检验学水准设定为0.05。

1.9 生物信息学分析

根据1.8的差异蛋白质结果进行生物信息学分析。分析各组间差异蛋白质对应基因的GO功能富集及KEGG通路富集情况，利用R语言clusterProfiler包绘制气泡图。利用String数据库得到差异蛋白质的互作网络，采用Cytoscape软件进行优化，并采用cytoHubba程序（MNC算法）计算节点数量输出核心蛋白质。

2 结果

2.1 一般情况

10例受试者的人口学资料和疾病用药情况如表1所示。为了突出冠心病血瘀证和健康人的差异性，冠心病患者来自心血管科病房或门诊，健康对照组为体检正常的在校研究生。患者经过门诊及病房系统确认冠脉狭窄＞50%或植入过支架。由于疾病观察组和对照组来自不同的人群，两组在年龄、体重、合并疾病数量、服药数量方面不具有可比性。

表1 受试者基线特征表

2.2 质量控制

在DIA检测的肽段中，蛋白质的相对丰度包括五个量级，载脂蛋白A-I(APOA1)表达水平最高，而鼻咽癌细胞内胆固醇转运蛋白2(NPC2)表达水平最低（图1）。各样品的平均偏差和DIA数据点均符合标准，表明该蛋白质组定量方法准确。对可信蛋白进行样品相关性分析，结果表明样品之间的分组情况和重复性良好（图2）。为了监测液相色谱-质谱的稳定性和定性定量数据的可靠性，在样品队列中，每隔一段时间，在一定数量的样品中插入一个质控样品进行相关分析，相关系数均在0.9以上。

图1 蛋白质相对丰度图

图2 样品相关性图

2.3 差异蛋白质表达分析

当FC=1.5时，冠心病血瘀证组相比于健康对照组，共鉴定到22个蛋白质下调，9个蛋白质上调（表2、图3）。其中上调的蛋白质包括：免疫球蛋白轻链λ型可变区3-25（IGLV3-25）、免疫球蛋白重链可变区3-23（IGHV3-23）、免疫球蛋白重链可变区3-43（IGHV3-43）、免疫球蛋白重链的恒定区域（IGHA2）、免疫球蛋白重链可变区3-49（IGHV3-49）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白轻链λ型可变区6-57（IGLV6-57）、免疫球蛋白重链可变区3-9（IGHV3-9）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）。下调的蛋白质包括：免疫球蛋白轻链可变区1D-13（IGKV1D-13）、免疫球蛋白λ型多肽1（IGLL1）、多聚蛋白2（MMRN2）、一种内皮细胞受体（ROBO4）、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPINA5）、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物亚基（IGFALS）、富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似蛋白1（SPARCL1）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）、多泡体亚单位12B（MVB12B）、白蛋白（ALB）、L选择素（SELL）、补体因子H（CFH）、补体因子H相关蛋白1（CFHR1）、血小板糖蛋白Ib α链（GP1BA）、血清血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS1）、细胞间黏附分子2（ICAM2）、转甲状腺素蛋白（TTR）、凝溶胶蛋白（GSN）、载脂蛋白L1（APOL1）、球蛋白/维生素D结合蛋白（GC）、细胞外基质蛋白1（ECM1）、磷脂转运蛋白（PLTP）。

图3 冠心病血瘀证组与健康对照组的差异蛋白质表达结果

表2 冠心病血瘀证组与健康对照组的差异蛋白质表达情况

2.4 差异蛋白的GO富集分析

对31个差异蛋白质（对应基因）进行GO富集分析，其生物学过程及分子功能的分析结果如图4所示。有11个基因富集在补体激活过程(complement activation)和体液免疫过程(humoral immune response)，有10个基因富集在（细胞）吞噬过程(phagocytosis)。有9个基因富集在B细胞介导的免疫反应过程(B cell mediated immunity)。有7个基因富集在膜内陷(plasma membrane invagination)过程(表3)。

图4 冠心病血瘀证组与健康对照组的差异蛋白质GO富集分析（top10）

表3 冠心病血瘀证组与健康对照组差异蛋白质的GO富集分析

2.5 差异蛋白的KEGG富集分析

对31个差异蛋白质（对应基因）进行KEGG富集分析，其通路富集的结果如图5所示。富集到3个以上基因的信号通路有一条，为：补体与凝血级联反应的作用通路（complement and coagulation cascades）（如图6所示）,图中的FH即为CFH，PCI即为SERPINA5，CFHR1/2/3/5即为CFHR1。

图5 冠心病血瘀证组与健康对照组的差异蛋白质KEGG富集分析

图6 补体与凝血级联反应

2.6 差异蛋白的互作网络分析

根据蛋白质互作网络分析（图7、图8），排名前10的核心蛋白质是ALB、CRP、TTR、CFH、GC、GSN、SELL、SERPINA5、GP1BA、IGFBP3。其中，ALB属于高丰度蛋白，应予排除。CFH基因与其他基因的互作程度较高，来源于实验研究与既往文献报道。此外，GCTTR、ALB-TTR、ALB-CRP互作关系的综合评分均较高。故初步推断冠心病血瘀证的核心蛋白质为C反应蛋白（CRP）、转甲状腺素蛋白（TTR）、补体因子H（CFH）、维生素D结合蛋白（GC）等。

图7 冠心病血瘀证差异蛋白的互作网络

图8 冠心病血瘀证的核心蛋白质

3 讨论

《素问·痹论》言“心痹者，脉不通……痹在于骨则重，在于脉则血凝而不流”。《内经》最早用“血凝”来描述胸痹的形成过程，提示“血瘀”是冠心病的基本病机。血瘀证是证候生物学研究的前沿领域。当前，血瘀证已被证明不仅与血小板结构、血管内皮细胞功能、动脉粥样硬化危险因素及冠状动脉狭窄程度密切相关[16]，在基因层面也存在许多调控靶点和调控网络[10,11]。血瘀证相关的蛋白质组学研究始自2005年[17]，既往研究大多数采用基于双向电泳或双向荧光差异凝胶电泳的蛋白质胶点鉴定[18-20]，也有少数采用基于iTRAQ或Label-free的定量蛋白质组学测序[21,22]。这些研究发现了一批血瘀证相关的蛋白质或肽链标志物，为血瘀证的客观化诊断提供了众多分子靶标，但存在检测技术的不足。本研究采用高通量质谱鉴定技术，结合生物信息学方法，对冠心病血瘀证的蛋白质表达差异作进一步分析。

在差异倍数为1.5时，研究共鉴定获得31个差异蛋白质，其中22个蛋白质低表达，9个蛋白质高表达。其中有代表性的蛋白质如C反应蛋白、多种免疫球蛋白超家族表达增加，转甲状腺素蛋白、载脂蛋白L1、维生素D结合蛋白、磷脂转运蛋白、多聚蛋白2、补体因子H、补体因子H相关蛋白1等表达下调，反映机体的炎症水平增高，正常代谢及营养储备下降。补体水平下调可能是因为慢性炎症反应的消耗所致。对这些差异蛋白质进行生物信息学分析，GO富集分析结果显示：有11个基因富集在补体激活、补体激活经典途径、免疫反应过程中。KEGG信号通路查询确定了补体与凝血级联反应的信号通路。蛋白质互作网络分析的结果表明C反应蛋白、转甲状腺素蛋白、补体因子H、维生素D结合蛋白等是核心蛋白质。由于三部分结果皆指向补体系统，笔者推测冠心病血瘀证的生物学过程与补体参与的慢性炎症反应有关，补体因子H是核心蛋白质。

补体系统是固有免疫应答的重要组成成分，体内经氧化修饰的低密度脂蛋白和胆固醇结晶等会激活补体系统参与动脉粥样硬化的发生发展[23]。其中，补体因子H（CFH）是一种负调节因子，可以避免补体系统过度激活所致的炎症反应，具有抗动脉粥样硬化作用[24]。既往多篇报道表明，补体因子H基因的多态性可能影响人对冠心病的倾向性，如CFH 1277CC基因型可能导致女性更易患冠心病，或者增加发生不稳定心绞痛的风险[25-27]。另外，CFH抑制补体的活化过程，常依赖补体因子H相关蛋白（CFHR）的调节而发挥生物学效应。CFHR的表达下降或缺失，会引起补体激活的旁路途径发生紊乱，临床上可导致IgA肾病、肿瘤等疾病[12]。本研究中，CFHR1、CFH皆属于显著下调的差异蛋白质，说明了补体系统代谢紊乱与冠心病血瘀证的重要关系。GO富集分析和KEGG信号通路图的结果也表明补体参与的慢性炎症反应是冠心病血瘀证的重要生物学过程。

有学者提出，血瘀证的生物学基础研究已深入到各类炎症因子和炎症介质，小分子炎症介质有望成为探究血瘀证物质基础的新思路[28]。而目前关于补体系统与血瘀证相关性的报道较少，本研究提供了合理依据，提示补体参与的慢性炎症反应可成为未来科学研究的方向，其中补体因子H具有成为标志物分子的潜力。本研究也存在一些不足，例如，研究纳入的样本量较小；研究纳入的患者未记录冠脉狭窄程度，导致患者的信息不全；观察组与对照组在年龄、体重等方面不具有可比性，这些因素可能成为重要的混杂因素。研究未对补体因子H进行扩大样本量的验证，日后还需完善方法学设计，以丰富血瘀证相关理论为目标，以明确活血化瘀药物作用靶点为导向，系统开展实验揭示血瘀证的科学内涵。