基于大缸奶样检测两病的应用及挑战

陈颖钰，李 翔，郭爱珍

（1.国家动物结核病专业实验室（武汉），武汉 430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，华中农业大学，武汉 430070；3.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；4. 华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

牛结核病和布鲁菌病在民间俗称“两病”，是影响奶牛业发展的重要疫病。前者主要引起呼吸道症状，导致奶牛的消瘦和咳嗽，并有可能通过飞沫或未经消毒的病牛奶传染给人；后者主要引起孕畜的流产、死胎等繁殖障碍，也有通过接触传染给人的风险。因此，“两病”不仅给养牛业带来巨大的经济损失，还对公共卫生造成巨大的威胁。

2016年《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》出台，明确指出奶牛结核病及布鲁菌病为优先防治的动物病种；到2020年需达到规划设定的考核标准，牛发病率下降到4%以下，动物发病率、死亡率和公共卫生风险显著降低。加上民众对“两病”认知程度的不断提高，对乳品要求的不断加大，养牛企业对两病的防控意识也在不断增加。“两病防控”达到了空前的高度。

疫病防控的首要步骤是“监测”。目前用于牛结核病的常用检测方法主要有皮试法、干扰素-γ体外释放法以及ELISA抗体检测法。这三种方法中，皮试法基于动物活体，需对牛进行两次保定并进行皮厚检测；干扰素-γ体外释放法及ELISA抗体检测法则基于血液，需要进行采血后进行检测。用于牛布鲁菌病的检测方法主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验及ELISA抗体检测等。三种方法都依赖于血清学检测，需要采血后进行检测。

无论是皮试还是采血，“两病”的常规检测方法均会对牛造成较大的应激，导致产奶量下降等反应，并需要大量的人力投入。在需要一年多次检疫的高风险地区则更是会导致较大的损失。

大缸奶（bulk tank milk, BTM）是相对于个体奶样而言的，为多头奶牛的混合奶样。规模化奶牛场多采样自动化挤奶设备将多头奶牛的原奶通过管道系统直接混合贮存，样本也极容易获得。由于原奶中含有一定比例的免疫球蛋白，且易于获得，相对血液而言能大大减少应激，且混合奶样的检测，可以获得与常规检测相同的效果[1]，很多国家便将疫病监测的对象瞄准了大缸奶，通过监测大缸奶样中的抗体水平，对疫病的群体状况进行掌控。虽然该种监测手段在很多国家已经十分成熟，但在我国除普遍将奶样检测用于乳腺炎诊断外[2]，其他疫病方面却少有应用。

在我国全面启动两病净化的形势下，无论是污染场、控制场或是净化场，定期进行实时监测都是必不可少的环节。大缸奶监测作为一种低应激、易跟踪、有效的检测方法，值得大规模推行。

1 大缸奶样检测的优势

对于奶牛场而言，泌乳奶牛在牛场中所占比例是比较大的。大量的临床经验都已经证实，无论是进行皮试检测，还是采血进行检测，都将对奶牛造成较大应激，造成产奶量的下降及品质的降低。通过检测奶样中的抗体，能够完全降低对奶牛的应激，不会有任何的副作用。并且大缸奶样的检测，更是能够有效降低成本和劳力。对检测结果而言，能够获得与常规检测相同的效果，并对整群的抗体流行状态进行监测，并且能够为新发传染病提供预警。因此应该作为疫病监测的重要手段，值得关注与应用。

2 大缸奶抗体水平具备作为疫病监测的能力

利用奶样进行动物疫病的检测具有显而易见的优势：应激少、样品易获得。因此很多国家都已利用奶样，甚至大缸奶样进行多种疫病的监测。通常认为，奶样中抗体水平比血样中的抗体水平要低一个数量级（即约为血清中抗体水平的1/10）。因此奶样中抗体水平能否反映，或者有多大能力反映血清中的抗体水平一直是国际上大缸奶抗体研究的重点。

早在1991年，瑞典学者就已提出大缸奶中的抗体检测完全可以作为奶牛场病毒性腹泻病的监测手段，大缸奶抗体与血样中抗体有着非常好的相关性[3]。斯堪的纳维亚半岛国家更是利用大缸奶对牛病毒性腹泻病进行监测，并配合使用血清学检测方法进行确诊，成功控制并根除了该病[4]；比利时、丹麦、葡萄牙国家也早就将大缸奶及个体奶样检测作为牛支原体病常规检测及监测的重要手段[5-7]；我国也有利用大缸奶抗体检测牛病毒性腹泻病流行情况的报道，结果显示77.8%的奶牛群体为阳性牛群[8]；爱尔兰通过检测奶样中的抗体水平确定奶牛支原体乳腺炎的流行状况[9]；丹麦则以一个非常系统的流行病学模型证实了牛奶中的抗体完全能够作为副结核病低流行率场的评估手段，且大缸奶样监测是最为经济有效的监测手段[10]；德国则早在二十世纪九十年代就官方授权许可了牛副结核病的奶样ELISA抗体检测方法，美国已开发出商业化检测试剂盒[11]。在澳大利亚，用于防控牛支原体的一个非常重要的生物安全措施就是对奶样进行PCR或ELISA抗体监测[12]。

有数据显示，血清和奶样抗体ELISA结果间有着非常强的相关性。当以血清抗体检测作为参考方法进行比对时，奶样ELISA检测的敏感性为60.9%，特异性高达94.6%[13]。一项基于奶牛副结核病检测的研究报告指出，在高阳性率群体中（血清学流行率≥10%），大缸奶样检测的敏感性为85.7%～71.4%。在阴性群体中，大缸奶样检测的特异性为70.5%～53%[14]。施马伦贝格病毒的血样及大缸奶样抗体检测比对分析发现，两种方法表现为高度相关（r=0.807，R2= 0.832）[15]，尤其对抗体低度高的群体，奶样检测具有非常强的预测能力。

当然，在利用大缸奶进行预测评估时，还必须要考虑到个体之间的差异。如干奶或育成牛可能因为没有收集奶样而缺乏检测，新产犊牛的母牛奶中抗体变化又较其他类型奶牛更大等，这些都有可能造成检测上的偏差。因此在进行群体预测后，仍需要对这部分个体进行个体水平的评估。

3 大缸奶样监测在两病监测中的应用

事实上牛布鲁菌病的检测很早就已经涉及了奶样：全乳环状试验很早就成为了牛布鲁菌病检测的经典方法[16]。同样的，全乳环状试验同样可以用在大缸奶的检测上，多用作牛布鲁菌病的筛检手段，对大缸奶检测出来的问题牛群再进行进一步的确诊[17]。在抗体检测方面，印度已将牛奶抗体检测作为牛布鲁菌病监测的重要方法，不仅评估了牛布鲁菌病的流行情况，更利用该方法对其风险因子进行了分析[18]。大缸奶用于布鲁菌病的监测，是英国法定控制体系的组成部分[19]，我国也有利用奶样检测牛布鲁菌病的研究[20]。有文献报道，奶样PCR可以检测出不少于100个布鲁菌的感染；而奶样ELISA则可以实现当1份阳性奶样混合在200头阴性奶样（大缸奶）中时，检测结果仍为阳性[1]；流行病学调查结果证实了奶样ELISA抗体检测与间接ELISA及竞争ELISA具有较高的一致性，且大缸奶的检测灵敏度较高，与血清检测结果保持一致，符合率分别为98.78%和97.56%[21]。

在牛结核病检测方面，韩国学者对用大缸奶检测奶牛结核病抗体水平进行了评价。当采用MPB70抗原进行牛结核病检测时，血样与奶样检测结果间表现出非常显著的相关性，R2为0.83。当采用皮试法作为参考方法时，奶样检测及血样检测的敏感性分别为87.8%和81.8%，特异性分别为97.7%和100%。当采用大缸奶对群体进行筛检时，阳性群的检出率比皮试高出约2倍[17]，表现出了良好的阳性群体预测能力，且大大节省了人力及降低了奶牛的应激。有学者对185个来自美国密西根的无结核病牛群和来自墨西哥的17个结核感染牛群的大缸奶样进行了ELISA抗体检测，结果显示，所有的阴性牛群的大缸奶检测结果均为阴性，82.4%的感染牛群大缸奶检测为阳性[22]。除抗体检测外，大缸奶检测在抗原检测也有一定的应用。巴西某学者从个体奶和大缸奶水平评价了结核分支杆菌复合群的流行率，结果显示，西北地区大缸奶中阳性率为2.15%，个体阳性率为1.91%，南部地区大缸奶中阳性率为1.91%，个体阳性率为1.6%[23]。进一步证实了大缸奶对奶牛结核病抗原的诊断价值。

4 大缸奶检测方法的挑战与应用建议

基于大缸奶检测的好处是显而易见的：降低成本、节约时间。但是也不可避免的存在一定的问题。其中最为关键的应该是大缸奶检测的敏感性。虽然部分研究显示大缸奶检测有较好的敏感性，但当群体中存在少量的阳性及大量的阴性个体时，大缸奶的混合则导致对阳性奶样的稀释而呈现假阴性结果。如何去对大缸奶检出的结果做出正确的判断，奶样与真实抗体水平究竟有什么样的推演关系，是目前学者们热烈讨论的问题，更是进行大缸奶检测过程中建模的重点。

由于大缸奶样的敏感性存在有一定的局限，因此在应用时并不适合作为牛病检测的确诊，但基于该方法的特异性较高，因此更适合将大缸奶样检测法作为筛选方法或作为预警，对其检测出来的阴性样本，认为是洁净群体，对阳性样本则通过血清学或其他敏感性更高的方法进行确诊来降低对个体的误判，减少随之带来的经济损失。

在动物疫病不断更新的形势下，早期、准确的对动物疫病进行判断，同时减少由多次检测带来的经济损失是养牛行业的新的追求。作为一种国际上成熟的，我们国家也正在趋向成熟的监测、预警方法，大缸奶样检测对两病的监测必将对两病的控制、根除及净化起到积极的推动作用，具有极为广阔的应用前景。