基于数据挖掘探讨中药治疗卵泡发育不良用药规律及实验验证

赵秀萍 马小娜 张秀平 陈妮妮 朱秀娟

(1 北京中医药大学第三附属医院妇科，北京，100029；2 浙江药科职业大学中药学院，宁波，315500)

卵泡发育不良(Follicular Dysplasia)是指卵泡的大小、数量、形态及生长速度异常而导致月经失调、自然流产或不孕症的一类疾病，超声监测下表现为卵泡发育停滞、卵泡闭锁、小卵泡排卵等形式[1]。在《女性生殖道病理学》[2]中指出卵泡发育不良从病理学角度为颗粒细胞增殖紊乱、没有卵泡腔的卵泡,或大小正常却含有大量考尔-埃克斯纳小体的卵泡。研究发现卵泡发育不良在不孕症和自然流产患者中的发病率差异较大，为27%～86.17%不等[3-4]。其反复发作且逐渐增高的发病率严重影响了育龄期女性的身心健康。

中医无“卵泡发育不良”病名，根据其临床表现可归属于“月经病”“滑胎”“不孕症”等范畴。近年来，中医药运用辨证论治及整体观念，因人制宜，在治疗卵泡发育不良过程中发挥了较显著的优势，其不良反应小，接受度高，一定程度上弥补了现代医学治疗该病的不足。但目前关于卵泡发育不良中医病因病机、辨证、治法尚无统一论述，多为临床经验用药。本研究收集近20年中医药治疗卵泡发育不良文献，借助数据挖掘分析近年来中医药治疗卵泡发育不良的用药特点及配伍规律，并通过动物实验探究聚类分析获得中药新方对排卵障碍大鼠卵巢功能的影响，从而为临床合理用药提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 文献检索 检索2002年1月至2022年1月由国家知识基础设施数据库(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)、中国生物医学文献数据库(China Biology Medicine Database，CBM)、中国学术期刊数据库(China Science Periodical Database，CSPD)及中文科技期刊数据库(Chinese Citation Database，CCD)、PubMed数据库中收录的全部中英文文献，并删除重复文献。本文以“卵泡发育不良(Follicular Dysplasia)”“小卵泡排卵(Small Follicle Ovulation)”“排卵障碍(Ovulatory Dysfunction)”“中药(Traditional Chinese Medicine)”“中西医(Traditional Chinese and Western medicine)”等为主题词。

1.2 纳入标准 采用有明确药物组成的中药复方或中成药组方治疗卵泡发育不良的临床随机对照试验。

1.3 排除标准 1)临床经验及理论类文献；2)动物及细胞实验研究；3)外敷、灌肠、等外用药物或针灸类临床研究；4)单味药及药物信息不全、疗效不确切的研究。

1.4 药物规范化及统计 将纳入文献的方剂录入Excel2019，提取中药名称，根据2020年版《中华人民共和国药典》[5]和《中药大辞典(上册)》[6]查询性、味、归经，对中药名称规范化处理：1)如桑葚→桑椹、仙灵脾→淫羊藿，炒当归→当归。2)有加减方药则只统计基本方。3)有重复名称或重复药物组成方剂则只统计1次。

1.5 聚类分析统计 数据由双人录入校对，进行二分类量化，方剂中出现该药物记录为“1”，未出现录为“0”，系统聚类分析设置最小聚类数5，最大聚类数为10，采用组间连接，以Pearson相关性分析，以树状图展示，得出新的用药配伍。

将高频药物量化处理，采用SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析及网络展示，图中线条越粗、颜色越重表示药物之间的关联度越强。再通过建模中关联的Apriori算法挖掘药物之间的配伍关系，设置最低支持度为25%，最小置信度为85%，最大前项数为3，提升度>1。

经2名副高以上妇科专家对以上聚类组方进行探讨，最后选用第三类组方(以下称补肾健脾方)作为动物实验用方。

1.6 补肾健脾方实验与方法

1.6.1 实验动物 选取鼠龄10 d左右SD雌性大鼠40只，体质量(40±5)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证编号SCXK(京)2016-0006]。所有大鼠均饲养在动物房内，保持室内温度恒定25 ℃，光照12 h明暗交替循环。所有大鼠均自由进食摄水，适应新环境5 d后进行后续实验。动物伦理审批由中日友好医院实验动物福利伦理委员会审批(伦理审批号:zryhyy21-20-12-1)

1.6.2 药物及试剂 实验中药购自北京中医药大学第三附属医院中药房，按临床常规用药剂量使用，第1次加6倍量水浸泡60 min，煎煮30 min，第2次加4倍量水煎煮30 min，合并2次煎出液，用旋转蒸发仪浓缩，换算成适合浓度以1 mL/100 g灌胃。来曲唑片(2.5 mg/片,江苏芙瑞制药公司,生产批号：210701)、丙酸睾酮注射液(1 mL：25 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司，批号：1810231)；雌二醇(Estradiol,E2)试剂盒(货号：AB-J0001B)、促黄体素(Lutropin，LH)剂盒(货号：AB-6623B)、促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)试剂盒(货号：AB-J0015A)、孕激素(Progestogen，P)试剂盒(货号：AB-2092A)，以上均购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司。

1.6.3 造模分组及给药 将大鼠逐一编号，通过随机数字表抽取，按数字大小排序，每10个数对应的大鼠为一组，选取其中一组10只大鼠作为空白对照组，在颈背部皮下注射等量生理盐水；其余30只大鼠参照文献[7]研究方法将大鼠颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25 mg/只(0.05 mL/只)。从第70日龄开始每天检查阴道脱落细胞涂片，连续10 d(2个性周期)，如阴道上皮无周期变化，细胞呈持续角化状态，则判断造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、来曲唑组、补肾健脾方组，每组10只。各组大鼠分笼饲养,在不施加处理时均自由饮水及每天给予标准颗粒饲料。来曲唑组：以5 mL含来曲唑7 mg/kg的生理盐水灌胃，连续3 d停药。补肾健脾方组：将新煮中药方以25 g/(kg·d)以1 mL/100 g灌胃，连续5周。对照组及模型组以相同体积蒸馏水灌胃，连续5周。

1.6.4 卵巢组织形态学观察 给药结束后，各组大鼠禁食12 h进行腹主动脉取血，备用，后经麻醉后处死，取两侧卵巢组织固定于4%甲醛溶液中，经脱水、浸蜡、包埋切片后染色，组织切片厚度为4 μm，光学显微镜下观察卵巢最大切面中各级发育卵泡、黄体数目情况。

1.6.5 酶联免疫吸附试验检测大鼠血清性激素水平 取腹主动脉血5～6 mL，离心分离，取上层血清置于-80 ℃冰箱中保存备用，按酶联免疫吸附试验试剂盒要求步骤操作进行FSH、LH、E2、P水平检测。

2 结果

2.1 数据挖掘

2.1.1 高频药物使用情况 本研究共纳入136篇文献，删除重复方剂，涉及132张处方，共计146味中药，总频次1 570次。用药频次≥20次的药物共27味，其中当归、菟丝子用药频次最高为98次，用药频率(单味药用药次数/处方数)为67.1%，其次为熟地黄92次，用药频率63%，枸杞子60次，用药频率41.1%，山药57次，用药频率39%。见表1。

2.1.2 证型分类 共纳入125篇记录了证型的文献，剔除6篇无对应病例数，涉及3 986例患者，共得到8种证型，主要包括肾虚血瘀证、肾阴虚证、肾阳虚证、肾虚肝郁证、肾气亏虚证。见表2。

表2 卵泡发育不良的证型分类

2.1.3 药物分类频数分析 将146味中药进行功能分类，主要有活血化瘀药、补阴药、补阳药、清热药、理气药等17类，其中补益药用药频率最高，共45次(补阴药15次、补阳药14次、补气药11次、补血药5次)、活血化瘀药用药频次为24次，其次为清热药、理气药、解表药。见表3。

表3 药物使用类别及频次

2.1.4 药物性、味、归经频数分析 将药物进行性、味、归经频次分析，其中药味使用频次最高者为甘味，共81次，其次为辛味、苦味，频次分别为53次、52次。见图1A；药性使用频次最高者为温性药，共48次，其次为平性，37次。见图1B；归经频数最高为肾经，共81次，其次为脾经、肝经、心经，频次分别为71次、56次、47次。见图1C。

图1 药物性、味、归经频次雷达图

2.1.5 高频药物关联规则分析 可见当归、菟丝子、熟地黄关联最密切。见图2。共挖掘核心药对14组，按支持度排序可见当归、熟地黄-菟丝子为核心药对，其次为熟地黄、枸杞子-当归。见表4。

表4 高频药物关联规则分析

图2 高频药物关联规则网络关系

2.1.6 高频药物聚类分析及选方 将高频药物聚类分析得到三类新方组合。类1包含山药、山茱萸、熟地黄、杜仲、续断、鹿角胶，以补肾药物为主。类2包含枸杞子、女贞子、鸡血藤、牛膝、白芍、柴胡、茯苓、当归、川芎、制香附、丹参、甘草，以补肾、疏肝、活血药物为主；类3包含白术、党参、黄芪、菟丝子、覆盆子、巴戟天、肉苁蓉、淫羊藿，以补肾、健脾、益气药物为主。见图3。经专家判定最后选用第三类组方(简称补肾健脾方)作为动物实验中药组用药，方药组成：白术15 g、党参30 g、黄芪30 g、菟丝子15 g、覆盆子10 g、巴戟天10 g、肉苁蓉10 g、淫羊藿10 g。

图3 高频药物聚类分析树状图

2.2 补肾健脾方对排卵障碍大鼠卵巢功能的影响

2.2.1 各组大鼠卵巢组织形态比较 对照组卵巢组织中可见各级卵泡发育，发育卵泡内颗粒细胞层数增多，排列密集，并可见多个黄体；模型组大多卵泡呈囊性扩张，形状不规则，颗粒细胞几乎消失，黄体少见；与模型组比较,来曲唑组及补肾健脾方组卵巢内卵泡囊性扩张明显减少，发育卵泡增多，颗粒细胞层次增加，且均有少许黄体生成，但来曲唑组卵泡数目多于补肾健脾方组。见图4。

图4 各组大鼠卵巢组织形态学比较(HE染色，×40)

2.2.2 各组大鼠血清性激素比较 与对照组比较，模型组大鼠血清中E2、P、FSH水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，来曲唑组及补肾健脾方组E2、P及FSH水平有所升高，但各组LH水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠FSH、LH、E2测定

3 讨论

3.1 证型及药物分析 卵泡发育不良被视为不孕症、自然流产的“未病”阶段[8]，临床中易周期性重复发生。西医主要采用促排卵药物治疗，但易出现子宫内膜生长与卵泡发育不同步、卵巢过度刺激综合征、卵巢低反应，黄素化未破裂综合征等并发症[9]。近年来，中医药在促进卵泡发育、改善排卵障碍、改善女性生殖功能等方面取得了较好的临床效果[10]。卵泡秉承女子先天生殖之精而生，其发育、成熟及排出均有赖于肾精、肾气的充盈。若肾精不足，胞宫失于濡养，则卵泡生长延迟或闭锁；若肾阳亏虚，动力不足，则卵泡排出障碍，由此可见，卵泡发育不良、排卵障碍根本之病因病机即肾虚[11]。本研究根据纳入有证型文献，归纳涉及8种证型，主要包括肾虚血瘀证、肾阴虚证、肾阳虚证、肾虚肝郁证及肾气亏虚证等。研究结果显示使用频次≥20次的有当归、菟丝子、熟地黄、枸杞子、山药、山茱萸、淫羊藿等27味中药，药性以温、平为主，微寒次之，药味以甘为主、辛、味次之。甘味药可补益五脏气、血、阴、阳之不足，多见于补益类药物，辛味药具有发散、行气、行血之功，多见于理气药及活血药。归经以肾、脾、肝为主，中医理论认为肾藏精，主命门真火，为先天之本，而脾主运化水谷精微，化生气血，为后天之本，2种相互资生，正如《医门棒喝》指出“脾胃之能生化者，实由肾中元阳之鼓舞，而元阳以固密为贵，其所以能固密者，又赖脾胃生化阴精以涵育耳”。

3.2 关联规则及新方组合 关联规则分析中，结合药对的支持度及置信度显示治疗卵泡发育不良的核心药对为当归、熟地黄-菟丝子。药对中当归味甘、辛、性温，可补血、行血，补中有动，行中有补，为血中之要药。熟地黄味甘，性微温，可补血滋润、益精填髓。在古籍《纲目》记载熟地黄可“填骨髓，长肌肉，生精血，补五脏、内伤不足，通血脉，利耳目，黑须发，男子五劳七伤，女子伤中胞漏，经候不调，胎产百病”。菟丝子味甘辛，性平，入肝、肾经，可补肾益精、养肝明目、安胎，三药共奏滋补肝肾，活血通络之功。临床中该药对存在于较多的中药处方中，用于治疗卵泡发育异常疾病。实验研究发现右归丸可增加大鼠卵巢血管数目，维持卵泡生长，减少卵泡闭锁，并通过下调C-X-C基序配体8(C-X-C Motif Ligand 8，CXCL8)/C-X-C趋化因子受体(C-X-C Chemokine Receptor，CXCR)1/2通路促进大鼠卵巢组织中血管的生成，从而改善卵巢功能[12]。毓麟珠可明显改善早发性卵巢功能不全患者的临床症状，降低FSH、LH并提高E2水平，并能增加卵巢基础窦卵泡数及子宫内膜厚度[13]。归芍地黄汤加减联合温针灸治疗卵泡发育不良不孕患者的疗效更为显著，能够改善卵泡发育情况及排卵结局，进而减轻临床症状，促进女性生殖轴平衡协调[14]。

聚类分析得到三类治疗卵泡发育不良的新方组合，类1包含山药、山茱萸、熟地黄、杜仲、续断、鹿角胶，以补肾阴为主，更加鹿角胶以温补肾阳，使得阴阳双补，用于治疗肾虚型卵泡发育不良患者。类2包含枸杞子、女贞子、鸡血藤、牛膝、白芍、柴胡、茯苓、当归、川芎、制香附、丹参、甘草。其中枸杞子、女贞子可滋补肝肾，鸡血藤、牛膝、丹参又可活血调经，柴胡、制香附可疏肝理气，甘草调和诸药，全方共奏补肾活血，兼以疏肝理气之功，可用于肾虚血瘀兼有气滞型的卵泡发育不良。类3包含白术、党参、黄芪、菟丝子、覆盆子、巴戟天、肉苁蓉、淫羊藿，以补肾健脾益气为主，方中在补肾药物基础上加党参、黄芪、白术等益气健脾等药物，先后天之本相互资生，使得脾气得以肾阳的温煦，肾中精气又赖脾运化的水谷精微不断补充，用于治疗脾肾不足卵泡发育不良。以上聚类分析进一步证实了卵泡发育不良与肾虚密切相关，临床施治时需要谨记兼顾健脾、活血、疏肝之法，不忘补肾的理念，因人而异，辨证选择不同的药物配伍。全方综合补肾健脾益气之功，取先后天之本相互资生之意。

3.3 补肾健脾方对排卵障碍大鼠的影响 本实验制备雄激素所致排卵障碍大鼠模型，运用聚类新方补肾健脾方干预排卵障碍大鼠，并将来曲唑作为阳性对照组，进而观察挖掘新方补肾健脾方对排卵障碍大鼠卵泡形态及性激素的影响。结果发现，模型组大鼠卵巢内卵泡多呈囊性扩张，颗粒细胞减少或消失，无黄体生成，而经补肾健脾中药干预后，卵泡发育及黄体数目与模型组比较均明显改善，且颗粒细胞与模型组比较数目增多，排列紧密。补肾健脾方组血清FSH、E2及血清P水平均与模型组比较明显升高。FSH作为促进卵泡发育成熟过程的一种促性腺激素[15],可以诱导颗粒细胞芳香化酶的活性,提高颗粒层细胞的雌激素含量，进一步促进颗粒细胞的增殖，从而促进卵泡发育成熟[16]。垂体脉冲式分泌LH可促进卵泡膜细胞合成雄激素,在窦前卵泡中发挥特殊作用,还可刺激优势卵泡颗粒细胞上的孕激素受体的表达[17]。可见，FSH、LH、E2及P等性激素共同协作参与卵泡的生长、发育及成熟，而补肾健脾中药可有效改善排卵障碍大鼠FSH、E2等性激素水平，考虑主要与补肾中药有密切关系，现代药理研究发现较多补肾中药均可发挥雌激素样作用参与下丘脑-垂体-卵巢性生殖轴之间的调节[18]。综上研究，我们认为补肾健脾之类中药，可以使胞宫得以温煦，气血得以濡养，故卵巢形态学有恢复趋势，性激素水平得以改善。

综上所述，本研究通过数据挖掘卵泡发育不良的用药规律，揭示了该病病机以肾虚为主，临床施治时需要以补肾为要，兼顾健脾、疏肝、活血之法。聚类分析获得补肾健脾方可有效改善雄激素所致排卵障碍大鼠卵泡形态，促进卵泡发育，改善血清激素水平。为临床治疗卵泡发育不良，改善女性生殖生育功能提供科学支撑。但由于数据库文献缺乏疾病与中药量效关系研究，并且药物成分、药代动力及药理机制等受中药炮制、用药途径、配伍等影响，今后需要联合基础实验、血清药理学进一步验证。