2018-2021年南山区食物中毒中肠炎沙门氏菌与布利丹沙门氏菌遗传特征和耐药性分析

袁 梦，袁月明，陈 辉，俞慕华，段永翔，胡鹏威

沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的主要食源性病原菌，肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidisS.Enteritidis) 是沙门氏菌在临床上最常见的一种血清型，是重要的人兽共患病的病原体，引起人类的胃肠炎和食物中毒[1]，据统计，约17%沙门氏菌食物中毒事件是由S.Enteritidis引起的[2]。2018-2021年，南山区由沙门氏菌引起的食物中毒事件中，除了常见S.Enteritidis外还有布利丹沙门氏菌(SalmonellaBlegdamS.Blegdam)，在我区以往的食物中毒检测中首次检测出S.Blegdam。S.Enteritidis与S.Blegdam同属于D群，均有O9、O12、Hg、Hm抗原，Hq抗原是两血清型别的唯一区别。因此本文将33株沙门氏菌进行PFGE溯源分型、全基因组序列以及耐药表型分析。了解此两型沙门氏菌的亲缘关系，导致食物中毒之间是否存在关联性，查找源头；CLC软件查找MLST管家基因与耐药基因，分析耐药基因与耐药表型之间的关系，为指导临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2018-2021年33株分离自食物中毒样品的沙门氏菌，经血清学鉴定为11株为S.Enteritidis，22株为S.Blegdam。药敏试验质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 主要仪器与试剂 全自动生化鉴定系统(法国生物梅里埃公司)、脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)、水浴摇床(美国赛默飞公司)；血清相关试剂(丹麦SSI)、SeaKem Gold Agarose(美国Cambrex公司)、XbaⅠ限制性内切酶与蛋白酶K(日本TaKaRa公司)、药敏试验相关试剂A-3与A-4肠道菌群药敏板(上海星佰生物技术有限公司)、全基因组提取试剂盒(美国Promega公司)。全基因组测序由华大基因股份有限公司完成。

1.3 菌株的分离鉴定 所有菌株经全自动生化系统鉴定为沙门氏菌。

1.4 PFGE分型试验 按照国家致病菌识别网技术规范—非伤寒沙门菌PFGE分型程序操作说明对菌株进行分型。

1.5 沙门氏菌全基因组提取 按照Promega试剂说明进行。

1.6 序列结果分析 采用The CLC Genomic Workbench (12.0 version)软件进行MLST管家基因、耐药基因查找以及K-mer进化树分析。

1.7 药敏试验 采用微孔稀释板法，按照试剂说明将稀释好的菌悬液加入A-3与A-4肠道菌群药敏板。所得MIC结果,根据美国临床实验标准委员会NCCLS(2012 年版)的判定标准，对实验结果进行敏感(S)、中度敏感(I)与耐药(R) 的最终判定。30种抗菌药物分别为：氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(AMS)、四环素(TET)、氯霉素(CHL)、复方新诺明(SXT)、头孢唑啉(CFZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(CFX)、庆大霉素(GEN)、亚胺培南(IMI)、萘啶酸(NAL)、阿奇霉素(AZI)、磺胺异噁唑(Sul)、环丙沙星(CIP)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX-C)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ-C)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、米诺环素(MIN)、阿米卡星(AMI)、氨曲南(AZM)、头孢吡肟(FEP)、美罗培南(MEM)、左氧沙星(LEV)、多西环素(DOX)、卡那霉素(KAN)、链霉素(STR)、吉米沙星(GEM)。

2 结 果

2.1 2018-2021年食物中毒病原检测结果

2.1.1 2018-2021年食物中毒事件 2018-2021年食物中毒起数分别是17、8、6、5起。每年细菌或病毒所致食物中毒分布见图1，仅2018年检测到由沙门氏菌引起的食物中毒事件。2018年由沙门氏菌引起的食物中毒事件共有6起，经实验室血清学检测鉴定为D群。3起血清学鉴定结果均为S.Enteritidis(O9、O10、Hg、Hm)；3起血清学鉴定结果为S.Blegdam(O9、O10、Hg、Hm、Hq)。

图1 2018-2021年引起食物中毒细菌及病毒分布图Fig.1 Map of pathogens causing food poisoning in 2018 to 2021

2.1.2 2018年D群沙门氏菌具体信息 2018年6起由D群沙门氏菌引起食物中毒发生的时间以及每起对应的编号及血清型别，见表1。

表1 D群沙门氏菌引起食物中毒的时间对应编号及血清型别Tab.1 Numbers and serotypes of group D Salmonella

2.2 PFGE分型结果 33株沙门氏菌(22株分离自肛拭子，11株分离自食品)分为8个PFGE型别，见图2。1～5起，每一起菌株间PFGE型别均一致。第6起的12株菌PFGE型别较为分散，分为6个型别，肛拭子与食品来源的菌株属于不同的型别，肛拭子与肛拭子之间，食品与食品之间的聚类结果均不同。PFGEⅠ型包含第6起的4株；PFGEⅡ型包含第5起3株，第6起2株；PFGEⅢ型均为第3起8株；PFGEⅣ型包含第6起3株，第1起2株；PFGEⅤ型与PFGEⅥ型均为第6起各1株；PFGEⅦ包含第2起7株；PFGEⅧ包含第6起与第4起各1株。

图2 33株菌PFGE聚类图谱Fig.2 PFGE cluster map of 33 strains

2.3 全基因组序列分析 33株菌全基因组测序后，测序结果用CLC软件进行分析(全基因组分析满足质控，Contig N50>20 kb，与参考菌株的覆盖度>99.0%以及匹配度>96.0%)。该软件数据库沙门氏菌共有766株菌，从K-mer进化树关系来看，见图3，33株沙门氏菌与数据库其它沙门氏菌比对为独立的一簇。33株菌的MLST型别均为ST11型， K-mer进化树、每株菌的血清型、PFGE型别、耐药基因谱、表型耐药谱、样品来源等分布详见图4。

图3 33株菌与CLC数据库沙门氏菌比对结果Fig.3 Comparison of 33 strains in the CLC Salmonella database

图4 K-mer进化树与各菌样品来源、血清型、耐药谱与耐药基因谱Fig.4 K-mer evolutionary tree, sample origin, serotype, drug resistance spectrum and drug resistance gene spectrum of each bacterium

2.4 32株菌基于SNP的系统发育树1～5起食物中毒，每起SNP差异数为1～4，见表2。不同起数之间SNP平均差异为17.8(标准偏差=5.4，10～27)，第6起食物中毒SNP之间差异较大。32株菌SNP的系统发育树见图5。

表2 每起食物中毒菌株SNP差异Tab.2 Differencesin SNPs among food poisoning cases

图5 32株菌SNP的系统发育树Fig.5 SNP phylogenetic tree of 32 strains

2.5 15种表型耐药检出情况 33株沙门氏菌进行30种抗菌药物检测，共检出15种抗菌药物，15种抗菌药物的具体检出率见图6。4种抗菌药物NAL、AMP、CFZ的检出率较高，分别为100.00%、57.58%、54.55%，均大于 50%。15种抗菌药物按照耐药的种类来分，分属于十大类耐药：β-内酰胺类(AMP、AMS、AZM)检出率为57.58%(19/33)；头孢菌素类(CFZ、CTX、CAZ、FEP)检出率为54.55%；四环素类(TET、DOX、MIN)检出率为15.15%；碳青霉烯类(IMI)检出率为3.03%；喹诺酮类(NAL)检出率为100%；磺胺类(Sul)检出率为66.67%；多肽类(CT)检出率为3.03%；链霉素类(STR)检出率为39.39%。仅1株来源于肛拭子(S-181)的沙门氏菌对IMI耐药，此菌耐6类抗菌药物(见表3)。

注：每种抗菌药物上方数字为相应的检出率图6 33株菌15种抗菌药物检出率Fig.6 Detection rates of 15 types of antibiotics in 33 strains

耐药3类以上属于多重耐药，20株菌耐药大于3类以上(60.60%)，11株菌(33.33%)耐1类药，2株菌(6.06%)耐2类药，8株菌(24.24%)耐3类药，2株菌(6.06%)耐4类药，7株菌(21.21%)耐5类药，3株菌(9.09%)耐6类药，每株菌耐药谱见表3。β内酰胺类-头孢类-磺胺类-氨基糖苷类-喹诺酮类与β内酰胺类-头孢类-喹诺酮类为优势耐药谱，检出率分别为21.21%与18.18%。其中7株(21.21%)菌产ESBL酶(S-182、S-185、S-187、S-188、S-189、S-190、S-191)，均来源于肛拭子，6株携带blaCTX-M-14基因。4株仅携带blaCTX-M-14基因，1株携带blaTEM-1B、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、sul2，1株携带blaCTX-M-14、aph(3″)-Ib，1株携带blaCTX-M-14、blaTEM-1B、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id。

表3 菌株耐药谱及耐药种类分布Tab.3 Drug resistance spectrum and species distribution

2.6 耐药基因与耐药表型异同 15株菌的耐药基因与耐药表型完全符合。S-187、S-190、S-213检出氨基糖苷类耐药基因但是未检出耐药表型。S-197检出氯霉素catA1耐药基因，但耐药表型为耐氨曲南。S-199、S-200、S-210未检出耐药基因，但耐药表型均对β-内酰胺类与喹诺酮类耐药。S-201、S-202、S-204检出大环内酯类耐药基因，但耐药表型仅表现喹诺酮类耐药。S-186、S-198、S-203、S-217、S-219、S-220、S-222未检出耐药基因，表型仅为喹诺酮类耐药。S-221检出β-内酰胺类耐药基因，但表型仅为喹诺酮类耐药。

3 讨 论

2018-2021年南山区由沙门氏菌引起食物中毒事情有6起，都发生在2018年均与D群沙门氏菌有关，血清学检测分别为S.Enteritidis与S.Blegdam。从血清学的角度，每一起食物中毒暴发事件之间血清型都吻合，但从食物中毒溯源角度，血清分型还不能说明相应的问题[3]。

PFGE作为沙门氏菌分型的金标准方法，对于溯源起到重要作用。4月份以来的食物中毒事件中，陆续分离出S.Enteritidis与S.Blegdam，第1、2、4、5起食物中毒因为采样等各种原因，仅有肛拭子样品，未进行食品及其它样品采集。第3和第6起链条相对完整，可以进行溯源研究。PFGE分型结果来看，D群沙门氏菌分为8个PFGE型别，Ⅰ-Ⅲ、Ⅳ-Ⅵ与Ⅶ-Ⅷ之间都有90%的相似度，分别来源于同一克隆。第3起的PFGE图谱一致，说明是食用相应的食品引起这起食物中毒；第6起食物中毒菌株，6份食品样品分属2个克隆4个型别(Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型)，6份肛拭子为同一克隆2个型别(Ⅰ、Ⅱ型)，食品与肛拭子分离菌株之间PFGE型别存在较大差异，鉴于此方法分辨能力有限[4-5]，故采用WGS对菌株进行进一步分析。

经全基因组测序，软件与数据库比对发现33株菌的MLST型别均为ST11型。WGS作为基因分析方法比MLST分型技术具有更高的分辨率[6]。仅靠MLST分型技术不能作为溯源研究。从图3，K-mer进化树关系分析可以看出，33株菌自成一簇，与数据库的其它D群沙门氏菌相差较远，属于新的克隆分支。通过WGS序列分析发现，第3起的S-202(腌制食品)与S-222(蛋黄液)的亲缘关系接近，S-200(腌制食品)与S-197、S-198与S-199(肛拭子)为一簇，而S-201、S-203、S-204(腌制食品)这几株形成另一簇，均由S-202进化而来，而S-202则由S-222与S-210(肛拭子)进化而来。

从SNP的系统发育树来看，可以进一步明确各暴发之间的关系。有文献报道，SNP差值小于3为划定暴发聚集的共同阈值[7]，因此1-5起食物中毒分离菌株，每起之间SNP差异小于3，均为同一暴发来源。由于第4起S-210与其它32株菌不在同一参考株下，故不参与SNP分析。第6起为多点暴发，SNP差异较大为0-42，SNP进化关系分为3种，肛拭子的来源为两种，食品为一种，单从暴发需SNP小于3的定义来看，导致食物中毒的关联较小，但从序列研究发现，S-223(蛋清液)与S-224、S-225、S-226(蛋糕)完全一致，提示该起为多点暴发，重点关注鸡蛋源头。推断该源头的沙门氏菌序列较散，由于没有挑取所有可疑菌落，因此造成食品分离株与肛拭子分离株序列差异较大。

所有菌株对抗菌药物100%耐药，均对喹诺酮耐药，与文献报道一致[8]。据文献报道，对喹诺酮类抗生素耐药的基因有部分为质粒介导[9]，本研究中对喹诺酮表型耐药，但全基因组测序中没有检测到相应质粒的耐药基因，因此需要进一步研究相应的质粒耐药基因。本研究中，15株耐药表型与耐药基因之间是完全吻合，其余菌株存在有耐药基因，但耐药表型未检出或者是耐药表型检出，未检出耐药基因，除了与质粒携带耐药基因外，其余有待进一步研究。环丙沙星为世卫组织推荐的沙门氏菌一线类用药[10]，本研究中虽没有检出环丙沙星耐药，但97%(32/33)的菌株为环丙沙星中介，对此药的敏感性降低与我国其它城市一致[11-12]，而中国西部、泰国以及伊朗报道此药的检出率分别为20%、51.1%与90.9%[13-15]。喹诺酮的高耐药性与环丙沙星敏感性降低有关，因此在用药方面需要一起考虑[16]。

菌株多重耐药较高，达到60.60%，低于我国其它8个省份沙门氏菌的多重耐药(70.2%)[17]。除了喹诺酮类，本研究对常用抗生素耐药排在前3位的分别为磺胺类(66.67%)、β-内酰胺类(57.58%)、头孢菌素类(54.55%)。我国，三代头孢作为禽畜类处理治疗沙门氏菌病的常用药物[8]，本文7株对三四代头孢类药物同时产生耐药，为ESBLs表型阳性的菌株。沙门氏菌能够产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectum β-lactamases，ESBLs)，编码该类水解酶的基因为CTX-M、TEM、SHV、PER、VEB、BES、GES、TLA、SFO 和OXA 等[18]。7株菌中，1株携带blaTEM-1B、1株携带blaCTX-M-14与blaTEM-1B、 5株携带blaCTX-M-14，ESBLs耐药基因型别不同存在地区差异[19-21]。产ESBLs的菌株，在治疗时应避免使用青霉素类、头孢菌素类和氨曲南类药物。第6起食物中毒大部分分离株属多重耐药，5株食品分离株(S-223、S-224、S-225、S-226、S-227)耐药大于四类，2株肛拭子分离株(S-216、S-218)耐药大于六类。肛拭子分离的菌株中，对四环素类的3种均耐药(DOX、MIN、TET)，食品分离菌株未检测到四环素类耐药，两者不一致的原因有可能是与上所述未挑取到所有可疑菌有关。

本研究对2018-2021年由D群沙门氏菌(S.Enteritidis与S.Blegdam)引起的食物中毒暴发菌株从PFGE与WGS递进角度进行分析。从WGS分析来看，2018年全年菌株遗传特征相近，与数据库其它菌株相差较远，进化出另一克隆分支。菌株存在多重耐药，一方面说明饲养方面抗生素滥用较为严重(蛋类检出多重耐药菌株)，另一方面在临床用药方面需多加考虑。

利益冲突：无