一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立

杜天飞，容新宗，杨盛理，张勇侠，武志强，李春阳，刘兰军

成都生物制品研究所有限责任公司 四川省疫苗工程技术研究中心，四川 成都 610023

抗胸腺细胞免疫球蛋白（anti-thymocyte immunoglobulin，ATG）和抗人T 细胞兔免疫球蛋白（antihuman T lymphocyte rabbit immunoglobulin，ALG）是一种含有抗淋巴细胞活性的免疫球蛋白制剂，靶向人T 淋巴细胞的多克隆抗体类药物，具有明确的生物活性免疫调节功能［1］。在临床上，ATG／ALG类制品作为免疫抑制剂广泛应用于肾移植、心脏移植、肝移植、骨髓移植及重型再生障碍性贫血（severe aplastic anemia，SAA）的治疗，且疗效显著［2-5］。目前，依据《中国药典》三部（2020版）（简称《中国药典》）规定［6］，采用淋巴细胞毒试验测定该制品的效价，该方法为传统的经典方法，在结果判定时通过光学显微镜观察淋巴细胞的死亡情况，计算死亡率，从而判定制品的效价，属于半定量方法。而《欧洲药典》（EP 9.0）对该制品的淋巴细胞毒效价测定方法为基于流式细胞仪测定杀伤率的方法，为定量方法。上述两种药典方法采用的靶细胞均为人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在活性评价研究中较大的难点在于靶细胞难于获得。基于ATG／ALG 类制品的开发与临床应用前景，便捷准确的体外淋巴细胞毒效价评价方法的开发显得尤为重要。

本研究旨在建立一种靶细胞更易获得，且可准确定量测定ATG／ALG 类制品效价的淋巴细胞毒试验方法，以期为ALG 产品的开发提供更为便利的检测手段。

1 材料与方法

1.1 免疫球蛋白 抗人T 细胞兔免疫球蛋白（商品名：Grafalon）为德国费森尤斯公司产品，批号：M07G-2／01，有效期：2022年6月，为人白血病T 细胞株Jurkat 的T 淋巴细胞作为免疫抗原免疫SPF 级兔制备的多克隆抗体［7-8］；兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（商品名：即复宁）为赛诺菲（北京）制药有限公司产品，批号：9W1011，有效期：2022年1月，为人胸腺细胞作为免疫抗原免疫SPF级兔制备的多克隆抗体。

1.2 细胞 人Jurkat 细胞株购自ATCC；人PBMC 购自妙顺（上海）生物科技有限公司。

1.3 主要试剂及仪器 RPMI1640 培养基购自美国Gibco 公司；新生牛血清（NBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；PI Staining kit 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔补体为3 ～4 周龄SPF 级兔采血离心分离血清得到；细胞计数仪（Countstar，IC1000）为上海睿钰生物科技有限公司产品；流式检测仪（2060R）为美国安捷伦公司产品；正常家兔血清（阴性对照）由本公司制备。

1.4 细胞培养 将Jurkat 细胞置于含10%灭活NBS的RPMI1640培养液中，于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

1.5 活性检测方法的建立 取对数生长期的Jurkat细胞，离心、计数后用PBS（pH 7.4）+20%FBS重悬，制备细胞密度为5×106个／mL的悬液备用。待检样品用PBS（pH 7.4）稀释至合适的浓度梯度，取50 μL加入96 孔V 底板中，再加入50 μL 制备好的细胞，最后加入50 μL 用PBS（pH 7.4）稀释5 倍的兔补体，混匀，置37 ℃，5%CO2培养箱中孵育30 min；4 ℃，200×g离心8 min，吸弃上清，细胞沉淀中加入PI Staining染料，混匀，室温避光放置5 ～10 min，流式细胞仪检测细胞杀伤率。以待检样品浓度和杀伤率拟合4 参数方程S型量效曲线，计算待检样品效价（EC50）。

1.6 方法的优化

1.6.1 反应体系的优化 在方法建立之初，考察反应体系孵育30 min后直接加入染料上流式细胞仪检测，以及反应体系孵育30 min后，4 ℃，200×g离心8 min，吸弃上清，细胞沉淀加入PI Staining上流式细胞仪检测。同时设3 个反应体系，比较在不同体系下效价测定结果的差异。体系1：50 μL 待检样品+ 50 μL补体（1∶5稀释）+50 μL细胞（5×106个／mL）；体系2：75 μL 待检样品+25 μL 补体（1∶5 稀释）+25 μL细胞（5×106个／mL）；体系3：75 μL待检样品+25 μL补体（原倍）+25 μL细胞（7×106个／mL）。

1.6.2 细胞培养密度对效价影响的检测 分别以2×105个／mL 的密度传代培养Jurkat 细胞72 h，3 ×105个／mL的密度传代培养细胞48 h，5×105个／mL的密度传代培养细胞24 h，按照同法收集细胞，以最佳反应体系组成测定Grafalon效价。试验重复2次。

1.6.3 细胞代次对效价影响的检测 考察不同代次（P10、P12、P15、P17、P20、P25）Jurkat 细胞对Grafalon效价测定的影响。

1.6.4 数据处理方法与系统检测要求 采用EXCEL 2010 软件对试验结果进行分析处理，使用GraphPad Prism 5 软件进行绘图与EC50分析。GraphPad Prism 5校正曲线的相关系数（R2）（4参数拟合）需≥0.980；体系空白对照细胞杀伤率＜10%；补体对照细胞杀伤率＜10%；阴性血清细胞杀伤率＜10%；Grafalon上平台杀伤率≥80%，下平台细胞杀伤率＜15%。

1.7 方法的验证

1.7.1 重复性 考察同一样品在96 孔V 底板不同布局效价测定结果的重复性。Grafalon 布局在96 孔板第1 ～3 列，以及第10 ～12 列，每个浓度梯度设3 个复孔，试验重复2次，计算变异系数（CV）。

1.7.2 中间精密度 在不同日期，对同一待检样品进行多次效价测定，考察中间精密度。

1.8 淋巴细胞毒效价人PBMC 杀伤活性的比较 分别在人PBMC 和Jurkat细胞体系中，对两种上市多抗进行淋巴细胞毒活性检测。PBMC 法参照《欧洲药典》（EP 9.0）各论中有关“人用动物源性抗T 淋巴细胞免疫球蛋白”章节（07／2013：1928）中淋巴细胞毒活性测定实验过程［9］。将人PBMC 用PBS（pH 7.4）+20% FBS 重悬制备密度为7 × 106个／mL 的悬液备用。待检样品稀释至合适的浓度梯度，取75 μL 加入96 孔V 底板中，再加入25 μL 制备好的细胞，最后加入25 μL 兔补体，混匀，置37 ℃，5% CO2培养箱中孵育30 min；4 ℃，200×g离心8 min，吸弃上清，细胞沉淀中加入PI Staining 染料，吹打混匀，室温避光放置5 ～10 min，流式细胞仪检测细胞杀伤活性。试验重复3次。

2 结果

2.1 Jurkat细胞测定淋巴细胞毒效价方法的建立 采用Jurkat 细胞作为靶细胞，加入Grafalon 在兔补体存在的反应体系中，37 ℃孵育30 min，加入染料PI Staining，流式细胞仪检测可见细胞明显杀伤，杀伤效果与Grafalon 浓度呈正相关。细胞对照的死细胞比率为6.05%，见图1A、B；孵育完成未离心直接染色上机，Grafalon 稀释128 倍，通过散点图可见，P1 门细胞比例仅为12.62%，表明细胞碎片量很大，见图1C、D，随着检测时间延长，会导致同一个样品布局在96 孔板第1 孔和最后1 孔杀伤效果的差异，从而造成假阳性；体系离心后染色上机，Grafalon稀释128倍，细胞杀伤率为55.28%，见图1E、F，更能客观真实反应样品活性。后续试验均采用孵育完成后4 ℃，200×g离心8 min后加入PI Staining染色上机。

图1 流式细胞术分析Jurkat细胞的杀伤效果Fig.1 Analysis of killing effect of Jurkat cells by flow cytometry

2.2 反应条件的优化

2.2.1 反应体系的优化 3 个体系组成均能较好地拟合4参数方程S型量效曲线，根据体系检测系统要求（上平台细胞杀伤率≥80%，下平台细胞杀伤率＜15%），且在3 个体系中，体系1 上下平台的信倍比最大，体系1 待检样品浓度、细胞量以及补体量组成最佳，即最优反应体系组成为50 μL 待检样品+50 μL补体（1∶5稀释）+50 μL 细胞（5×106个／mL）。见图2和表1。

表1 不同体系组成主要参数比较Tab.1 Comparison of main parameters of different system compositions

图2 不同体系组成对Grafalon 淋巴细胞毒活性量效曲线的影响Fig.2 Effect of different system compositions on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

2.2.2 细胞培养密度对效价的影响 以2×105个／mL的密度传代培养72 h 和3 × 105个／mL 的密度传代培养48 h，细胞生长状态较好且一致，Grafalon 测定活性更接近，且灵敏度更高，能更好地反应待检样品Grafalon的活性。见图3和表2。

图3 不同细胞培养密度对Grafalon 淋巴细胞毒活性量效曲线的影响Fig.3 Effect of different cell culture density on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

表2 不同细胞培养密度对Grafalon 淋巴细胞毒活性测定的影响Tab.2 Effect of different cell culture density on determination of Grafalon lymphocytotoxic activity

2.2.3 细胞代次对效价的影响 当细胞生长状态较好且一致时，从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致，见图4和表3。

图4 不同代次细胞对Grafalon 淋巴细胞毒活性量效曲线的影响Fig.4 Effect of various cell passages on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

表3 不同代次细胞对Grafalon淋巴细胞毒杀伤活性的影响Tab.3 Effects of various cell passages on killing activity of Grafalon lymphocytotoxicity

综上，生长状态较好的细胞传至P25 代，试验前细胞密度按2 × 105个／mL 或3 × 105个／mL 传代，以50 μL待检样品+50 μL补体（1∶5稀释）+50 μL细胞（5×106个／mL）反应体系测定活性，均能得到符合检测体系要求的杀伤数据，测定6 次Grafalon 效价非常接近，能很好地反应待检样品的活性。

2.3 方法的验证

2.3.1 重复性 板内重复检测结果的CV值为6.32%，表明该方法重复性良好。见图5和表4。

图5 Grafalon板内重复性淋巴细胞毒杀伤量效曲线Fig.5 Intraplate repetitive dose-response curve of killing activity of Grafalon lymphocytotoxicity

表4 Grafalon活性板内重复性检测结果Tab.4 Results of intraplate repetitive determination of Grafalon activity

2.3.2 中间精密度 不同代次细胞试验均在不同日期完成，即对同一样品Grafalon完成多次活性测定，6次测定结果的CV值为4.15%，表明该方法中间精密度良好。

2.4 淋巴细胞毒效价人PBMC 杀伤活性的比较 基于人PBMC 的淋巴细胞毒效价，即复宁的活性高于Grafalon 约3 倍。对于Jurkat 细胞作为免疫原制备的Grafalon 类产品，依据多克隆抗体产生的机理，以Jurkat细胞作为靶细胞得到的淋巴细胞毒效价，仍能很好地反映其活性。见表5。

表5 基于PBMC细胞以及Jurkat细胞淋巴细胞毒杀伤活性比较Tab.5 Comparison of killing activity of lymphocytotoxicity based on PBMC and Jurkat cells

3 讨论

市售的ATG／ALG 产品免疫原大致分为两类：人胸腺细胞或人传代T 淋巴细胞免疫健康的马、兔、猪等动物得到［10］，其药理机制主要为通过直接淋巴细胞毒性、补体介导的T 淋巴细胞溶解等途径特异性诱导淋巴细胞凋亡，从而对T细胞、B 细胞以及NK细胞造成广泛的免疫耗竭［11-13］。《欧洲药典》（EP 9.0）各论中有关“人用动物源性抗T 淋巴细胞免疫球蛋白”章节中规定可使用传代人T淋巴细胞或胸腺细胞作为免疫原［9］。余健等［14］采用传代人T淋巴细胞免疫猪得到符合《中国药典》对该品种效价规定的多克隆抗体，且认为Jurkat细胞作为免疫原的优势在于含有多种T 细胞表面蛋白；免疫原的批间均一性更好；可规模化生产，可见采用传代人T 淋巴细胞如Jurkat细胞作为免疫原将会是一个更具潜力的研究方向。

根据药理机制，《中国药典》测定效价的方法为淋巴细胞毒试验及E 玫瑰花环形成抑制试验，这两种方法均为半定量法。《欧洲药典》（EP 9.0）对该制品的淋巴细胞毒效价测定方法为基于流式细胞仪测定杀伤率，该方法为定量法。从方法的灵敏性以及对样品效价准确评价的角度来说，定量方法更优。《中国药典》与《欧洲药典》对于ATG／ALG产品效价的测定，均采用人PBMC 作为靶细胞，由于健康人全血来源人PBMC的获得较困难，且分离保存的人PBMC批间一致性差异大，针对ALG 产品开发中早期免疫策略制定、多抗血清效价筛选以及中间品控制开发，便捷准确的效价测定方法显得十分必要。

本研究方法是以传代人淋巴细胞Jurkat作为靶细胞的淋巴细胞毒效价测定方法，对于Jurkat细胞作为免疫原制备的Grafalon类型产品，从多克隆抗体产生的机理来看，能很好的测定其活性。本研究基于Jurkat细胞的淋巴细胞毒活性测定方法为业界提供了方便、易得且准确的定量检测方法。对于该方法的进一步应用，企业还可深入研究各自品种基于Jurkat细胞淋巴细胞毒效价与人PBMC淋巴细胞毒效价的相关性，建立两种方法的对标关系，本研究中基于人PBMC的淋巴细胞毒效价，即复宁的活性高于Grafalon约3倍，与前期报道结果趋势一致［15-16］。中间品以及成品最终效价的确定采用Jurkat细胞淋巴细胞毒效价测定方法值得推广。

综上所述，本研究开发的基于Jurkat细胞的淋巴细胞毒效价定量测定方法，靶细胞易得，重复性好，能定量测定ALG 效价，为ALG 产品的开发提供了更为便利的检测手段。