脑源性神经营养因子在下咽鳞状细胞癌中的表达及临床意义*

任艳茹 檀子峤 姚孟薇 杨欣欣 徐 静 李晓瑜△

(1济宁医学院临床医学院，济宁 272013;2济宁医学院附属医院，济宁 272029)

下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)占所有头颈部恶性肿瘤的3%左右，是头颈部恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一，据相关研究报道下咽癌患者的5年总生存率仅为30%～35%[1]。近50%的患者在诊断后一年内复发，且多发展为远处转移[2]。因此，进一步了解HSCC的致癌机制及有效靶点对尽早干预、防止复发、提高预后具有十分重要的意义。

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，最早由德国学者在猪脑提取液中发现的一种碱性蛋白[3]。它通过其与细胞表面受体发生配体-受体反应激活各种关键信号通路[4]。BDNF作为目前肿瘤领域研究的热点，过往文献证明BDNF在喉癌[5]、甲状腺癌[6]等头颈部肿瘤中高表达，其高表达可以促进肿瘤的生长、侵袭、转移、上皮-间充质转化和化疗耐药性[7-8]。目前BDNF在HSCC癌组织中的表达情况及其对HSCC侵袭转移能力的影响却尚未报道。本文旨在探讨BDNF在HSCC中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年4月至2016年12月我院耳鼻喉科手术中用于病理检查留取的33例HSCC癌组织、22例HSCC癌旁组织以及12例行悬雍垂-腭-咽成形术(UPPP)的正常咽部黏膜组织石蜡包埋组织切片标本。纳入标准：1)符合HSCC临床诊断标准，经病理检查证实；2)临床资料完整；3)排除由其他肿瘤侵犯或转移；4)患者及家属均知情并签署知情同意书。本研究已通过济宁医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 细胞株与试剂

细胞株:人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞，购自iCell Bioscience Inc。

MEM培养基、胎牛血清、青链霉素双抗混合液(Gibco)；胰蛋白酶消化液(BIOTOP)；冻存液(美伦公司)；4%多聚甲醛(索莱宝公司)；结晶紫染色液(5×结晶紫染色储液+稀释液)(凯基生物公司)；Matrigal基质胶(Corning)；磷酸盐缓冲液(福州迈新公司)；EDTA抗原修复液pH 9.0；内源性过氧化物酶阻断剂(北京中杉金桥公司)；兔抗人 BDNF 多克隆抗体(Affinity公司)；兔抗人TrkB多克隆抗体(Proteintech Group)；抗体稀释液(Proteintech Group)；增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物通用型二抗，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)。苏木素-伊红染色液、二甲苯、75%、95%、无水乙醇、中性树胶封片剂等均由我院病理科实验室提供。

1.3 二步法免疫组织化学染色

通过免疫组织化学染色检测33例HSCC癌组织、22例HSCC癌旁组织及12例正常咽部黏膜组织中BDNF表达量。按照试剂说明书步骤进行通用二步法免疫组织化学染色，脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、孵育一抗、次日取出组织切片，PBS洗片2min×3次、滴加适量反映增强剂、滴加即用型二抗增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色、苏木素染色、将染色后的石蜡切片放置于上行梯度浓度的酒精中脱水、透明、封片，储存。

免疫组化结果判读：由两名病理科专业医师在光学显微镜下采取双盲法判定。观察细胞膜和细胞质，在组织中阳性表达时染色为棕黄色或褐色颗粒，调节至400×镜下随机选择5个视野计数细胞并根据阳性细胞所占比例(0分：<5%；1分：5～25%；2分：26%～50%；3分：>51%)及染色强度(0分：无色；1分：浅黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色)进行评分。以上两项积分相加≥3分时判定结果为阳性。

1.4 Transwell侵袭实验

对照组：不含BDNF的MEM完全培养基中生长的FaDu细胞；实验组：在含400ng/ml BDNF刺激因子的MEM完全培养基中生长的FaDu细胞，每组均设置3个副孔。

将Matrigal基质胶提前一天从-20℃冰箱转移至4℃冰箱，使其由固态变为液态，用MEM无血清培养基按1∶2稀释Matrigal基质胶，用预冷枪头吸取50μl稀释好的Matrigal加入Transwell上室，37℃恒温培养箱内过夜孵育基质胶，吸出上层液态的不凝胶，使薄层Matrigal基质胶沉积底部。取生长状态良好的各组FaDu细胞，更换为MEM无血清培养基饥饿过夜，常规消化、离心，用MEM无血清培养基重悬至单细胞悬液，计数后调整FaDu细胞浓度至1×106个/ml。于Transwell下室中加入30% MEM完全培养基600μl，向Transwell上室每孔滴注100μl各组细胞悬液(1×105个/孔)。放置于37℃恒温培养箱内过夜培养，取出24孔板，弃去上室培养基，吸除剩余培养基及基质胶，将小室浸于500μl 4%多聚甲醛小孔，室温下固定30min后，蒸馏水清洗3次，再浸入500μl预先配制的结晶紫溶液中，室温下染色30min后，蒸馏水清洗3次，用棉签轻轻拭去上室未穿膜FaDu细胞。将小室放置于倒置显微镜下观察，400×视野下随机选取5个视野计数，结果取平均值。

1.5 统计学方法

采用SPSS25.0软件进行统计学分析，通过Fisher精确概率法进行统计学分析。采用GraphPad Prism 5软件对Transwell侵袭试验结果进行统计学分析，以P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 BDNF在HSCC癌组织、癌旁组织及正常咽部黏膜组织中的表达情况

光学显微镜下显示BDNF在组织中主要表达在细胞膜和细胞质，在组织中BDNF阳性表达时染色为棕黄色或褐色颗粒(图1示)。

注：A为正常咽部黏膜组织切片；B为下咽癌癌组织切片；C为下咽癌癌旁组织切片。

2.2 BDNF在HSCC癌组织、癌旁组织及正常咽部黏膜组织中的表达

正常咽部黏膜组织中BDNF表达的阳性率为0(0/12)；22例HSCC患者癌旁组织有7例可见BDNF阳性表达，阳性率为31.8%(7/22)；HSCC患者的癌组织中28例可见BDNF阳性表达，阳性率为84.8%(28/33)。BDNF蛋白在HSCC癌组织中的表达显著高于癌旁组织及正常咽部黏膜组织，具有统计学意义(P<0.0125)；且在HSCC癌旁组织中的BDNF蛋白阳性表达明显高于正常咽部黏膜组织，具有统计学意义(P<0.0125)。

表1 BDNF在下咽癌组织及癌旁组织、正常咽部黏膜组织中的表达差异

2.3 BDNF表达与下咽癌临床病理参数之间的关系

下咽癌组织标本中BDNF蛋白的表达与肿瘤直径、分化程度、是否淋巴结转移及临床分期相关(P<0.05)，与性别、年龄及浸润深度无关(P>0.05)。见表2。

表2 下咽癌组织中BDNF的表达与临床病理学参数的关系

2.4 BDNF对FaDu细胞的侵袭能力的影响

外源性BDNF明显增强FaDu细胞的侵袭能力，两组间差异性具有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3。

注：A为对照组穿膜的Fadu细胞;B为400ng/ml浓度组穿膜的Fadu细胞。

注：与对照组相比，***P<0.05。

3 讨论

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是上呼吸道最常见的恶性肿瘤，HSCC约占所有HNSCC的3%，然而却是所有头颈部恶性肿瘤中预后最差的一种[3]，这与其早期即出现区域淋巴结转移和随后的远处转移扩散有关，这是HSCC的一个重要特征[9]。HSCC治疗手段包括手术切除，放射疗法(RT)或化学疗法。对于特定的早期病例(T1和部分T2期患者及无淋巴结转移者)，可以采用单纯手术切除治疗方式，而晚期HSCC则需要手术切除及放、化疗联合的综合性治疗[10]。下咽局部有丰富的淋巴网络，使肿瘤可以早期扩散到颈部和咽后淋巴结，增加了转移的机会，导致HSCC患者预后较其他头颈部肿瘤相对较差。因此，找寻新的有意义的治疗靶点对于HSCC的治疗和远期预后具有重要意义。

肿瘤细胞中存在BDNF/TrkB自分泌通路，BDNF/TrkB通路与肿瘤细胞的形成、侵袭转移以及耐药性[11]相关。BDNF除了在神经系统肿瘤中高表达外，在呼吸系统、消化系统、血液系统及生殖系统的肿瘤组织中同样发现表达上调[12-15]。BDNF/TrkB信号通路在头颈部多种肿瘤发生发展过程中的重要作用[8,16]，但BDNF在HSCC中的表达情况及对于HSCC侵袭转移能力的影响知之甚少，因此，研究BDNF对于HSCC的生长浸润转移及预后的影响有重要的价值。

通过免疫组化实验，我们发现：1)HSCC组织中肿瘤直径>2cm的患者BDNF蛋白的表达水平明显高于≤2cm的患者；2)中低分化的患者BDNF蛋白的表达水平明显高于高分化的患者；3)有淋巴转移的患者BDNF蛋白的表达水平明显高于无淋巴转移的患者；4)Ⅲ、Ⅳ期患者BDNF蛋白的表达水平明显高于Ⅰ、Ⅲ期的患者。以上各组间差异均有统计学意义。本文中浸润至肌层及以下的患者与浸润至黏膜下层的患者的BDNF蛋白的表达率无统计学差异，分析可能原因：1)由于样本量较少导致统计学差异不明显；2)本文中所收集晚期患者(Ⅲ及Ⅳ期)较多，肿瘤恶性度普遍较高，从而影响BDNF蛋白的表达差异性。我们认为增加样本量，丰富不同肿瘤分期，可使统计学差异更加显著。

大量新生血管的形成是另一个与肿瘤远处侵袭转移密切相关的因素，BDNF在血管生成的过程中是必不可少的[17]，Kermani等[18]发现BDNF有双重促血管生成的作用，其既可以通过局部激活内皮细胞亚群表达的TrkB受体，也可以通过主动募集骨髓源性干细胞的方式促进血管内皮生成。通过这种双重促血管生成活性，与血管内皮生长因子(VEGF)共同作用促进生成新生血管，达到促进肿瘤生长和侵袭转移的作用[19]。

Kupferman等[20]发现BDNF参与喉癌及舌癌的生长过程，并且可以诱导细胞迁移和上皮-间充质转化(EMT)的形成。BDNF在肿瘤微环境中可以通过成纤维细胞(CAFs)控制的旁分泌轴协助淋巴结转移，与正常成纤维细胞相比，含有来自头颈部肿瘤患者相关成纤维细胞(CAFs)的条件培养基可促进头颈部细胞增殖、细胞浸润、耐受化疗药物以及淋巴结转移，从机制上证明了BDNF在头颈部肿瘤发生及进展过程中的重要作用[21]。这一过程也被Dudás等证实，通过在无血清培养基中培养成纤维细胞，发现激活的成纤维细胞，也可以产生高水平的BDNF，能够诱导肿瘤细胞EMT形成，并且发现使用TGF-β1处理舌鳞状细胞癌SCC-25细胞后可抑制其生长，而BDNF处理后可恢复SCC-25细胞的生长，认为BDNF可以提高肿瘤细胞存活率，从而导致患者预后恶化[22-23]。

本文根据上述文献的报道进一步验证HSCC的侵袭转移能力是否与BDNF相关，在免疫组化结果证实BDNF在HSCC组织中高度表达的基础上，我们以外源性BDNF作为刺激因子培养FaDu细胞，通过Transwell侵袭实验，发现与对照组相比外源性BDNF(400ng/ml)处理后的FaDu细胞穿膜数量更多，侵袭能力明显增强，两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，与上述文献报道结果一致，以此证明BDNF的表达与FaDu细胞的侵袭转移密切相关。

综上所述，BDNF蛋白在HSCC癌组织中表达水平显著高于癌旁组织及正常咽部黏膜组织，且表达水平与肿瘤直径、分化程度、是否淋巴结转移及临床分期密切相关；并且通过实验发现BDNF蛋白可促进下咽鳞状细胞癌细胞系FaDu的侵袭转移能力，进一步说明BDNF的表达对HSCC的侵袭转移有作用。临床上可通过检测BDNF的表达来辅助判断患者肿预后，后期实验也可通过BDNF作为切入点进一步研究所涉及的相关通路，期许找到HSCC潜在的治疗靶点。