鸭疫里默氏杆菌耐药机制研究进展

刘玲俐，赵亚楠，靳亚洁，祁晶晶，田明星，王少辉，李 涛，于圣青

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）是一种可引起鸭、鹅、鸡、火鸡等禽类急性或慢性败血症的黄杆菌科革兰氏阴性菌。该菌对水禽的感染在世界范围内均有报道，并由于其可造成家禽较高死亡率、低饲料转化率从而给家鸭养殖业造成严重的经济损失，由于RA血清型众多，彼此之间无交叉保护，因此，现阶段抗生素仍是防控RA的主要手段。然而抗生素的长期使用，使得RA在药物选择压力下，对药物敏感的菌株被抑制或杀灭，而药物抵抗菌株则获得生存优势，继续繁殖和克隆传播，导致RA临床分离株耐药率逐年上升。现有文献表明，RA基因组中抗药性基因的比重已大大提高，临床分离株多重耐药现象十分严重。流行病学研究调查显示，不同区域、不同血清型的RA对不同抗菌药物的耐药水平存在一定差异[1-5]。同时，RA对抗菌药物产生耐药性通常是在多种因素共同作用下的结果。本文综合国内外相关文献，对RA耐药机制研究现状进行总结。

1 外排泵系统

外排泵系统是介导RA内源性和获得性耐药的一种主要机制，它通过泵出菌体细胞内的抗菌药物，使其不能发挥作用。但是由外排泵系统引起的细菌耐药性通常为非特异性。

仲崇岳等[6-7]通过对比分析加入外排泵抑制剂羰基-氰-间氯苯腙（CCCP）前后，RA对β-内酰胺类抗菌药物敏感性的变化，证明了RA临床株携带跨膜质子梯度能驱动型外排泵，并且初次总结出外排泵系统是与RA对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类药物的耐药性相关。在此基础上，金龙翔[8]检测了CCCP对RA二代氟喹诺酮类抗菌药物敏感性的影响，实验结果表明，主动外排泵系统与RA对大部分二代氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性相关，但主要影响RA对诺氟沙星和环丙沙星的敏感性，并不影响RA对左氧氟沙星的敏感性。Chen等[9]在台湾地区分离的66株RA中，检测出9株氟苯尼考耐药株，通过PCR扩增，发现这9株耐药菌株均携带编码外排泵蛋白的floR基因，药敏实验证明，该外排泵系统与RA对氯霉素和氟苯尼考的耐药性相关。利用基因组高通量测序技术，Wang等[10]发现RA ATCC11845株基因组中，携带两种外排泵编码基因：小多重耐药家族（small multi-drug resistance family, SMR）和主要易化子超家族（major facilitator superfamily, MFS），猜测其可能与RA对抗菌药物的耐药性有关，但未进行实验证实。Zhang等[11]在RA-CH-1中，鉴定了一个编码耐药结节化细胞分化家族（resistance nodulation cell division family,RND）外排泵RaeB的基因B739_0873，药敏实验证明该基因的缺失会增强RA对氨基糖苷类药物和洗涤剂的敏感性。同样，李生斗[12]在RA-GD株中，鉴定了一个编码ATP结合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily, ABC）外排泵MarB亚基的基因RIA_1614，利用基因缺失技术，证实该基因的缺失会增强RA对氨基糖苷类药物和有机溶剂的敏感性。Chen等[13]借助外排泵抑制剂及实时荧光定量PCR技术，证实了外排泵基因与RA耐药表型之间有一定关联，但不是绝对关联，同时作者认为外排泵抑制剂可以考虑应用于临床治疗。现阶段，相对其他种属细菌，RA发现、鉴定的外排泵种类仍不多，其功能研究也多局限于同源基因的比较，较少涉及外排泵排出药物机制研究，这与RA缺乏成熟、稳定的基因突变系统有关。

2 细胞膜通透性的改变

革兰氏阴性菌可以通过改变细胞外膜的通透性，来降低菌体内抗菌药物浓度或者阻止抗菌药物进入细菌体内。仲崇岳[7]发现临床株RA14、RA58和RA59这3株菌株对苯唑西林、头孢吡肟、头孢噻肟、青霉素的MIC值均不受外排泵抑制剂CCCP的影响且对部分药物显示为耐药表型，通过头孢硝噻吩法和PCR扩增方法，检测其β-内酰胺酶表型及基因型均为阴性，猜测这3株分离株的药物耐药机制可能是由于细胞膜通透性降低而引起。此外，仲崇岳[7]利用人工诱导耐药方法，构建了RA43头孢吡肟耐药株，SDS-PAGE电泳检测原始头孢吡肟敏感株和人工诱导耐药株外膜蛋白，结果显示，诱导后RA43的外膜蛋白条带和诱导前有所不同，在大约20 kDa和45 kDa处各有2条条带发生缺失，作者推测外膜蛋白缺失导致细胞膜通透性改变是导致RA43发生耐药性改变的主要原因之一。目前，临床常用抗菌药物多为亲脂性，可自由进入RA细胞膜磷脂双层结构，特别是β-内酰胺类抗生素很容易通过RA细胞膜上存在的孔蛋白通道进入胞内，然而当外膜的渗透性发生改变，如基因突变导致部分种类孔蛋白通道关闭或缺失，RA就会产生对该抗菌药物的耐药性，目前该耐药机制多见于β-内酰胺类药物。

3 药物靶基因突变

病原菌可以通过使药物作用靶位点基因发生突变的方式，来改变药物作用靶位点蛋白的结构，从而改变药物接合位点的空间构象，使其与药物的亲和力降低甚至不能与药物结合，从而导致药物药效降低甚至失活[14-15]，由于细菌突变进化速度较快，药物靶基因突变导致的耐药机制是细菌产生药物抵抗性主要原因。刘颖等[16]对比分析了喹诺酮类药物耐药菌株与敏感菌株的gyrA基因喹诺酮类药物决定区（quinolone resistance determinational region,QRDR）核酸序列，发现耐药菌株通过碱基突变，使QRDR对应位点的氨基酸发生突变，从而使喹诺酮类药物作用靶蛋白DNA促旋酶A亚基空间构象发生变化，导致RA对喹诺酮类药物的敏感性降低、耐药性增强。孙亚妮等[17]分析了30株RA诺氟沙星耐药株gyrA基因QRDR，发现氨基酸突变位点主要是QRDR第83位和第87位氨基酸，其中9株Ser83突变为Arg83，21株Ser83突变为Ile83，30株RA耐药株中，Gly87均突变为Asp87。在此基础上，Sun等[18]分析发现RAgyrA双突变株（第83位和第87位氨基酸同时突变）对喹诺酮类药物的抗性水平显著高于单突变株；同时，该研究还证实了RA菌株中与喹诺酮类药物耐药相关的另一基因parC基因QRDR突变热点不同于大肠杆菌[19]、铜绿假单胞菌[20]及胸膜肺炎杆菌[21]，parC的QRDR中只检测到一个突变热点Arg120Glu，作者推测该位点氨基酸的突变可能与环丙沙星耐药相关，因为在gyrA和parC中均有突变的分离株比gyrA单突变株表现出更高的环丙沙星耐药性。Sun等[22]对18个RArpoB基因氨基酸序列的比较分析和利福平MIC测定表明，以下5个氨基酸位点突变与利福平耐药相关：V382I、H491N、G502K、R494K和S539Y，这些氨基酸的突变导致rpoB基因编码的RNA聚合酶β亚基空间构象发生改变，使利福平无法与作用靶位点之间形成紧密的分子作用力，从而致使利福平无法通过阻止RNA转录发挥抗菌作用。

4 产生灭活酶或钝化酶

细菌可以通过产生灭活酶的方式，使进入细菌菌体内的抗菌药物结构发生改变，然后转变为对细菌无活性的代谢物，失去抗菌药物原本的活性。近年来，耐药基因流行病学分析结果表明，RA中能够检测到的灭活酶的数量和种类越来越多，主要可以分为以下几类：

4.1 灭活氨基糖苷类抗生素的钝化酶 钝化酶是耐药菌株产生的可通过水解或修饰作用破坏药物活性基团，从而使药物失效的蛋白酶。刘颖[23]通过PCR方法，对RA进行9种常见氨基糖苷类钝化酶基因的检测，检测到ant(3")-I基因。蔡秀磊[24]在22株临床分离的RA中，检测到编码核苷转移酶的aadA5、aadA1基因和编码酰基转移酶的aac6-II基因。Sun等[18]通过PCR方法，对103株RA氨基糖苷类药物的钝化酶基因进行检测，检测结果如下：共发现了6种氨基糖苷类药物的钝化酶基因，包括aph（3'）-VII、aadAl、aadA2、aac（3'）-IV、aac(3')-IIc、aac(6')Ib。此外，杨芳芳[25]采用PCR方法，从2005-2006年临床分离到的38 株RA中检测出了ant(3")-Ia、aac(6')-Ib和aph(3')IIa这3种氨基糖苷类钝化酶基因，且其核苷酸的同源性与大肠杆菌和沙门菌中的氨基糖苷类耐药基因核苷酸的同源性很高。在此基础上，李翠[26]将氨基糖苷类敏感株E.coli8099与氨基糖苷类耐药株RA P3进行混合培养，获得了氨基糖苷类耐药结合子大肠杆菌E1，进一步研究发现，结合子从RA P3菌株中获得了编码氨基糖苷类乙酰转移酶aac6-I基因，说明aac6-I导致的氨基糖苷类耐药可在RA与E.coli之间水平传播。

4.2 灭活氯霉素的乙酰转移酶cat基因可编码乙酰转移酶，催化乙酰辅酶A乙酰化能力，从而改变氯霉素的分子结构，最后形成1，3-二乙酸氯霉素，导致氯霉素失去抗菌活性[27]。蔡秀磊[24]在22株临床分离的RA中，检测到catB3基因。Huang等[28]通过PCR方法，对192株RA分离株进行检测，检测结果表明：有69株RA携带catB3基因，其中RA-CH-2携带有2个拷贝的catB3基因（G148_1769和G148_1772），作者利用自杀载体pRE112进行同源重组使catB3基因缺失，并测定突变株对氯霉素的MIC，结果表明：当这两个基因同时缺失时，RA-CH-2对氯霉素的敏感性增强了8倍，说明catB3基因与RA对氯霉素的耐药性相关。

4.3 灭活林可酰胺类药物的核苷酸转移 核苷酸转移酶是调控DNA合成和修复的关键酶和限速酶，可催化4种核糖核苷酸还原，生成相应的脱氧核糖核苷酸。Luo等[29]首次证明RA-CH-2中G148_1775基因，所编码的蛋白是一种新型的林可酰胺核苷酸转移酶，与其他报道中林可酰胺核苷酸转移酶的同源性小于41%；通过体外动力学测定，表明该蛋白可以抑制林可酰胺类药物的抗菌活性，从而使RA对该类药物产生高水平的耐受性；此外，作者还发现G148_1775基因可通过转化的方式，使ATCC 11845对林可霉素和克林霉素的MIC分别增大512倍、32倍，猜测该基因的广泛存在，是RA对林可酰胺类药物普遍耐受的主要原因。

4.4 灭活四环素类药物的氧化还原酶 产生灭活四环素类药物的氧化还原酶是病原菌对四环素类药物（四环素、米洛环素、多西环素、替加环素等）具有耐受性的主要原因之一，其中以tetX基因为代表。Li等[30]利用转座子随机突变技术，使编码氧化还原酶的M949_0459基因（tetX同源基因）失活，通过对比CH3及其突变株对替加环素的MIC，证明了RA氧化还原酶可增强CH3对替加环素的抵抗性。此外，Zhu等[31]发现RA菌株中tetX基因存在水平转移现象，可使四环素敏感株变成耐药株。

5 产生修饰酶

erm基因编码的核糖体甲基化酶可以使病原菌核糖体亚基甲基化，从而导致大环内酯类药物不能与其作用靶位点结合。Luo等[32]通过PCR方法对206株RA进行检测，结果发现有64株RA携带有编码核糖体甲基转移酶的ermF基因，基因缺失实验证明，ermF基因的缺失会增强RA对林可酰胺类抗菌药物和大环内酯类抗菌药物的敏感性，使RA对红霉素、阿奇霉素、泰乐新和林可霉素的MIC分别降低1024、1024、4和2048倍。Xing等[33]同样证实了由ermFU基因或ermF基因编码的甲基化酶是导致RA对红霉素耐药的主要机制之一；此外，他还发现与其他病原菌一样，RA携带的ermF和ermFU基因也可增强对大环内酯-林可酰胺-链球菌B组抗生素的耐药性[34]。

6 小结

近年来，病原菌耐药性的出现和传播已成为公共卫生领域日益严重的问题。除某些病原菌具有固有耐药性，能对某些种类的抗生素具有天然的耐药性，许多敏感菌也可通过环境诱导基因突变及耐药基因水平转移的方式获得耐药性。流行病学调查结果显示，RA耐药菌株分离率逐年上升，但现有研究文献多偏重耐药表型分析，对于RA耐药机制的研究不够全面。综合相关文献，我们可以看出RA对抗菌药物产生耐药性是多种因素共同作用的结果，但是这些机制在生物体内共同作用的过程是一个极其复杂的生理生化过程，对于这一方面的研究仍然任重而道远。进一步研究RA对各种药物的耐药机制，不仅有利于预防和治疗RA感染、指导兽医合理应用抗生素，同时还可为研发新型药物、制定有效治疗方案提供理论依据。