炎症信号通路的DNA甲基化在类风湿关节炎发病机制中的研究进展①

张明媚 魏 萌 （西南交通大学医学院，成都 610031）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种受遗传和环境等多因素影响的慢性炎症性自身免疫性疾病，其发病机制尚不明确［1］。研究表明，高风险的遗传背景和表观遗传学改变，会诱发滑膜炎，导致关节破坏，同时累及关节外的许多器官。环境因素对遗传易感个体的影响在RA 疾病的发生和发展中具有重要意义。机体内环境的变化会引起基因表观遗传学的改变，因此人们对表观遗传学的研究将有助于揭示RA 的发病机制［2］。在基因的多种表观遗传调控机制中，DNA 甲基化检测技术较为成熟和全面，因此该领域研究相对较多。DNA 甲基化最常见的功能是在某些特定类型细胞中，通过启动子区域差异性甲基化位点的改变，从而调节附近基因的转录及表达。早期对基因甲基化的研究发现，RA 中某些特定基因（如 IL-6、IL-10 和趋化因子CXCL12）发生了异常的甲基化改变［3］。应用芯片技术进一步对全基因组表观遗传改变进行分析，系统地筛选出不同细胞中与RA 相关的甲基化标记物［4-5］。之后对筛选出的差异性甲基化位点和对应的基因进行功能富集分析，构建出可能激活炎症的信号通路。同样，通路中的关键基因发生改变，导致mRNA表达和蛋白质翻译出现障碍，进而引起RA的发病。目前已在RA 的不同类型细胞中分析出多个差异性甲基化基因及信号通路。

1 Hedgehog信号通路

在人的生长发育过程中，Hedgehog（Hh）信号通路对关节软骨的生长和分化起着重要的调控作用［6-7］。Hh 信号通路由Hh 配体、蛋白受体（Patched，Ptch）、Smoothened（Smo）受体和转录因子Gli组成［8］。受体Ptch 能与配体直接结合，对Hh 信号传导起负调控作用。Smo主要作用是胞内信号的传导及调节核转录因子 Gli 的表达。Ptch 以 Ptch-1 和 Ptch-2 两种异构体存在，Ptch-1 在Hh 途径激活中起到关键作用。当Ptch-1 在接收到Hh 蛋白信号时，解除对Smo受体的抑制作用，进而使转录因子Gli 进入细胞核参与mRNA转录的过程Hh信号通路被激活［9-10］。

有研究表明，关节软骨破坏与RA 患者关节不可逆的生理功能障碍有关，因此需重视对软骨损伤的治疗和干预［11］。在正常生理条件下，软骨细胞的稳态是通过细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）的合成和分解来维持的，ECM是由Ⅱ型胶原（COLⅡ）和蛋白聚糖的纤维组成的［12］。在RA 中，基质金属蛋白酶、促炎细胞因子、一氧化氮、蛋白聚糖酶等多种病理因素引起ECM 代谢失衡，最终导致软骨破坏［13］。但其中哪些分子起调控作用仍不清楚。LI等［14］以胶原诱导的大鼠作为模型，取成模大鼠膝关节软骨，检测 Smo、Ptch-1、Gli 蛋白含量及 mRNA 表达量，发现模型组大鼠Smo、Ptch-1、Gli 蛋白含量及mRNA 表达量明显增高。由此推测，Hh 信号通路参与RA 软骨损伤的发病，并且Hh 关键基因的表达量影响RA患者软骨的侵蚀程度。

SUN 等［15］对 Hh 信号通路中的关键基因进行了探究，发现甲基化抑制剂处理后，胶原诱导的RA 大鼠FLSs 中的Ptch-1 明显升高，提示Ptch-1 蛋白水平的降低是DNA 甲基化的结果。同时发现RA 中X 染色体上甲基化CpG 结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2）增加，抑制高甲基化的Ptch-1，从而激活Hh信号通路。

2 TNF-α/NF-κB信号通路

自20 世纪80 年代以来，该通路被证明参与了多种生物学途径，包括炎症、细胞活化、增殖和分化。NF-κB（nuclear factor-κB）家族包括了5名成员：P105/P50（NFKB1）、P100/P52（NFKB2）、P65（RELA）、RelB（RELB）和c-Rel（REL）。在静息状态下，该通路关闭；当细胞受到外界刺激时，NF-κB 抑制剂（inhibitor of κB，IκB）激酶复合体活化，将 IκB 磷酸化，使NF-κB暴露核定位点，游离的NF-κB迅速转位到细胞核，诱导相关基因转录［16］。

滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）是关节滑膜的主要基质细胞。FLS 产生滑液的ECM，因此对软骨的完整性和关节的润滑非常重要。FLSs 增殖、活化，进而侵袭和破坏邻近软骨，造成患者关节畸形，影响生活质量。

KAROUZAKIS 等［17］通过测序发现RA患者FLSs中转录因子T 细胞介导的转录调节因子（T-box transcription factor 5，TBX5）呈低甲基化状态，同时TBX5 的mRNA 和蛋白质表达量明显增加，从而对NF-κB信号传导产生影响，导致促炎介质的释放，加重RA 患者的炎症反应。之后对TBX5 进行了更深入的探究，发现miRNA-10a-5 的下调，能够促进TBX5 的表达，因此TBX5 有可能会成为治疗RA 慢性炎症的靶点［18］。NF-κB信号通路的下游靶点的阐释对于RA 的治疗具有重要的指导作用。学者们认识到TNF-α 是该信号通路下游主要的炎症因子，发现TNF-α 抑制剂能够抑制单核细胞释放趋化因子单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，CCL2），从而使RA 病情得到缓解。具体机制为：TNF-α 抑制剂通过降低甲基转移酶含量，调控CCL2 启动子区域的DNA 甲基化状态，从而抑制NF-κB 信号通路中的 CCL2 表达［19］。该研究表明TNF-α 抑制剂对靶DNA 甲基化的调节是其治疗RA的潜在机理。

3 JAK/STAT信号通路

JAK/STAT 信号通路广泛参与外周血细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程。该通路由JAK蛋白家族和转录因子STAT 构成，细胞因子与JAK家族蛋白受体结合，激活JAK/STAT 信号通路，引起JAK 的磷酸化，进而引起 STAT 的磷酸化，STAT 从细胞质转位到细胞核，之后锚定胞核中的特定DNA 位点，参与转录过程。这个家族中与JAK 活化有关的受体可分为白细胞介素（IL）受体、干扰素（IFN）受体和集落刺激因子受体［20］。

ZHU 等［2］分 离 RA 患 者 外 周 血 单 个 核 细 胞（PBMC），运用Illumina 450K芯片对PBMC 全基因组进行DNA 甲基化状态的检测，筛选出差异性甲基化位点和相对应的基因。随后，运用因果推理和功能富集分析的方法，探究差异性甲基化位点与mRNA表达量的关系，最终根据推理，找到了IFN-γ 依赖的JAK/STAT 信号通路。同时还发现通路中的聚合酶家族成员-9（polymerase family member 9，PARP9）是诱导RA 外周血细胞增殖的关键基因。由此推测，PARP9 有可能特异性地抑制RA 患者PBMC 的增殖，进而调节RA患者的炎症进程。

目前，JAK 抑制剂不仅有效地应用于治疗成人RA，并且儿童的RA患者服用JAK抑制剂，也可有效控制RA病情活动［21］。

4 Wnt信号通路

Wnt 信号中的关键成员能够激活FLSs，使其增殖和分化，从而侵蚀RA 患者的关节软骨和骨，最终造成关节畸形［22］。Wnt信号通路对骨骼发育和软骨与骨转化产生密切影响，对骨代谢的动态平衡调节起着重要作用。Wnt 信号通路的关键成员有：Wnt蛋白、Wnt受体、Dishevelled蛋白、β-catenin、GSK-3β、Axin/Conductin、APC 蛋白等。当 Wnt 蛋白与受体结合，该信号通路激活，Axin 去磷酸化，使得β-catenin定位于细胞核，随后通过T 细胞因子/淋巴增强子结合因子（T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor，TCF/LEF）转录因子诱导，最终使目标基因转录，并影响后续的细胞反应的发生。

KAROUZAKIS 等［23］对正常人（nRA）、18 个月之内诊断为RA 患者（veRA）以及患病时间大于18 个月RA 患者（estRA）的FLSs 的DNA 进行差异性甲基化分析，筛选出启动子区域差异性甲基化位点。结果发现，RA 患者的DNA 启动子区域呈现明显高甲基化状态，而且estRA 患者的甲基化水平也高于veRA 患者，这表明RA 的起病和发展与启动子区域的甲基化状态有密切关系，同时基因运用功能富集分析方法，构建出差异化明显的基因对应的Wnt 信号通路。之后，LI 等［24］观察到 CTNNB1 基因编码的β-catenin 在 RA 患者的 FLSs 中表达量明显升高，从而激活Wnt 信号通路，各种炎症因子IL-6、IL-10 以及TNF-α 释放，最终引起关节软骨和骨的破坏。此外他们还发现，长非编码RNA MALAT1 能够诱发CTNNB1 的基因启动子区域甲基化，进而抑制CTNNB1 基因的表达及下游信号通路的激活，因此MALAT1有望成为RA患者临床治疗的靶点。

5 PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT 是生物体中广泛存在的一种激酶信号通路，与细胞的增殖、分化和凋亡具有密不可分的联系。AKT 信号通路不仅在调控肿瘤细胞周期中起着重要作用，与RA 的FLSs 生长和增殖也密切相关。PI3K 是由催化亚基P110 和调节亚基P85 组成的蛋白二聚体。当PI3K激活后，在细胞膜表面形成第二信使PIP3，PIP3 与细胞内的信号蛋白中的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和丙酮酸脱氢酶激酶 1（pyruvate dehydrogenase 1，PDK1）结合，促使PDK1磷酸化，进而活化AKT。

LI 等［25］研究发现，肿瘤抑制因子蛋白酪氨酸激酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）能够负性调节PI3K/AKT 信号通路，即PTEN 处于活化状态，PI3K/AKT 信号通路将无法激活，释放炎症因子，导致机体的病变。当RA大鼠的FLSs 中的PTEN 呈现高甲基化状态，那么PTEN基因的表达受到抑制，在RA大鼠的FLSs中检测到AKT1，FI3K/AKT 信号通路激活，趋化因子（CCL2 和CCL3）和炎症因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）释放，从而导致FLSs的增生、肥大，严重时可侵犯周围组织，使关节扭曲变形，造成不可逆的严重后果。

因此，推测PTEN 有望成为RA 治疗的有效靶点，PTEN 基因的甲基化水平是否可作为RA 的诊断标志物需要进一步探索。

6 其他信号通路

除以上几种常见的炎症通路外，趋化因子家族基因甲基化的差异，使其介导的趋化因子信号通路激活和HLA 家族基因的甲基化差异，使T 细胞相关受体信号通路的激活，从而导致炎症的发生，造成RA 患者滑膜病变［26］。然而，MAPKs 信号通路途径，TLRs 信号通路，RANKL/RANK/OPG 信号通路都与RA 发病和疾病的活动有关［27-30］，但这些通路关键基因甲基化状态尚不清楚。需要对这些通路进行更加深入的研究，以期能尽可能明确RA的发病机制。

综上所述，RA 的发病机制与多条信号通路相关，其中 Hh 信号通路、TNF-α/NF-κB 轴、JAK/STAT途径及Wnt信号通路上的关键基因发生甲基化的异常变化，从而影响对应信号通路的激活和基因表达。因此，通过药物对这些通路中筛选出的关键基因的甲基化进行调控，进而抑制或激活相关的信号通路，有可能成为RA治疗的新靶点。