单核细胞增生李斯特菌基于基因组学的分型和溯源技术研究

王 也，凌志婷，徐 尧，张 琴，殷月兰，焦新安

1 前 言

单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes, LM)可导致动物和人李斯特菌病，是一种重要的食源性致病菌，可分为4个系统发育谱系(Linage I～IV)[1]。LM易感染孕妇、老年人、儿童等免疫力低下人群，引起患者败血症、脑膜炎、孕妇流产等症状，感染后的病死率可达20%～30%[2]。LM对低温、高盐等条件有较强的抵抗力，在自然环境中广泛分布。LM可污染饲料和农场并通过养殖、屠宰、加工、存储等环节传播，增加了人和动物李斯特菌病暴发的风险，引起了世界各国的高度关注[3]。

微生物的分型方法可分为基于表型的分型方法和基于微生物基因的分型方法[4]。表型分型方法包括传统细菌分类学的种属鉴定、血清分型、噬菌体分型等。基于微生物基因的分型方法则是运用生物信息学技术，对基因组高通量测序数据进行比较分析，包括多位点序列分型、核心基因/全基因组多位点序列分型、单核苷酸多态性分析和CRISPR分型等[5]。分子分型技术在流行病学调查和溯源分析中具有重要作用。

随着分子流行病学的发展，比较基因组学分析方法已被广泛应用于病原菌的分子分型、溯源调查，以及对细菌耐药特性、致病机制、分子进化速率等方面的研究[6]。本文重点对目前应用于LM研究领域的各种基于基因组学的分子分型方法进行综述，以期为李斯特菌病的预防控制提供参考。

2 基于基因组学的分型和溯源技术

2.1 多位点序列分型 多位点序列分型(MLST)是一种基于基因组多位点序列分析的细菌分型方法，最初是通过PCR扩增7个LM管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA)特定区段并进行序列测定，根据多个等位基因序列的差异进行分型[7]。随着基因组测序技术的发展，目前可直接根据基因组测序数据进行MLST分型。MLST分型方法对菌株型别的定义易于标准化，可通过网络数据库进行数据交换和比对，已成为LM 流行病学研究中应用最广泛的分子分型方法[8]。

利用MLST不仅可将菌株分为不同ST型，还能将不同的ST型进一步聚类分析，目前各不同ST型的LM菌株可聚类成至少48种不同的克隆群(CCs)。从临床感染病例分离的CCs主要为高毒力菌株，包括CC1、CC2、CC4和CC6等；从环境、食品分离的CCs，包括CC9和CC121等；同时还有一些中间CCs，包括CC8、CC87等，既有临床感染分离株也有环境、食品分离株[9-10]。国外LM暴发相关的CCs型主要为CC1、CC2、CC4和CC6，而我国感染病例与食品中检出的主要CCs型为CC8、CC9、CC87[11]。与传统分型方法相比，MLST操作简单、耗时短，能够进行简单的溯源以及菌株系统发育分析。但MLST对菌株基因组信息的挖掘不够深入，对亲缘关系较近的分离株难以进行准确有效的溯源和系统发育分析。

2.2 CRISPR分型 CRISPR分型是利用WGS数据直接进行分型的一种分型方法。CRISPR (Clustered Regularly Inter-spaced Short Palindromic Repeats) 是由间隔子(spacers)和定向重复序列(DR)组成的DNA片段，和Cas蛋白组成完整的CRISPR-Cas系统，该系统是一种原核适应性免疫系统，通过将外源DNA片段整合到CRISPR阵列中而发挥功能[12]。CRISPR阵列中的间隔子夹在DR之间，是细菌噬菌体感染微生物的记录，同时也是CRISPR-Cas系统这种获得性免疫的标志。具有相似间隔子或间隔子样式的分离菌株具有较高的同源性，这就是基于CRISPR进行分子分型的理论基础[13]。

20世纪90年代中期，前人对结核分枝杆菌的CRISPR基因座进行了广泛的研究，并利用其间隔子的高度多态性首次开发了一种称为间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)的分析方法[14]。随后又陆续开发出了基于其他致病菌间隔子的亚型分析方法，如用于鼠疫耶尔森菌、白喉棒状杆菌、弯曲菌、沙门菌的CRISPR分型方法[15-18]。近年来，关于LM的CRISPR分型开展了一些研究，Di等发现LM血清型1/2a和1/2b菌株的CRISPR序列多样性程度较高，可利用CRISPR序列差异进行分型，且其分辨能力较PFGE更强[19]。Wang等结合Cas蛋白和CRISPR的结构及序列特征，建立了CRISPR-Cas分型技术，对64株LM分离株进行CRISPR-Cas系统分析，发现其能区分13株无SNP差异的菌株[20]。此外，CRISPR分型用于LM分子流行病学研究仍有一些局限，例如不容易区分间隔区高度保守的大部分谱系Ⅰ、Ⅲ菌株，同时一些LM菌株没有完整的CRISPR系统，这些均影响了CRISPR分子分型方法的发展。

2.3 核心基因/全基因组多位点序列分型 近年来，基于基因组高通量测序数据建立了核心基因/全基因组多位点序列分型 (cg/wgMLST)用于LM的分子流行病学监测[21]。其中cgMLST通过对数据库中全部菌株的基因组分析，筛选出菌株代表性的共有基因位点，LM的cgMLST分型方案通常包含了1 700个左右相对保守的基因位点即核心基因组位点。而wgMLST则包含了数据库中菌株共有的全部基因位点即全基因组位点，用于分析LM的wgMLST分型方案包含的全基因组位点数一般为2 800至3 000个。Ruppitsch等开发的cgMLST分型方案将等位基因数差异≤10的LM菌株聚类在一起从而区分暴发菌株和无关菌株，成功地对一起由受污染的酸凝乳奶酪引发的李斯特菌病暴发进行溯源，确定暴发菌株为2株1/2a 型LM分离株[22]。Cabal等对1 960株LM菌株进行cgMLST聚类分析，对多起LM感染暴发成功进行了溯源和菌株的系统发育分析[23]；Papic’B等人首次利用基于WGS数据的几种分型方法，对反刍动物李斯特菌病暴发进行溯源分析，结果表明wgMLST可明确区分使用PFGE无法区分的LM分离株[24]。cgMLST和wgMLST分析的结果大致相同，由于cgMLST分析考虑的基因组位点数少，对数据质量、阈值的要求相对较低，能够满足大多数情况下对菌株的溯源及系统发育分析要求，因而更常用于LM的分子流行病学研究[25]。

虽然cg/wgMLST已广泛应用于多起LM暴发的溯源分析以及菌株的系统发育分析，但其只能评估核心基因组数据中存在的差异，没有涉及基因组其他部分数据，可能遗漏一些基因信息，如在基因间区域或非常罕见的辅助基因中的多态性差异，这些都会影响分析结果准确性[26]。此外，cg/wgMLST分析需要具备对数据进行生物信息学处理的专业能力，因而限制了其更广泛的应用。同时cg/wgMLST分析中阈值与等位基因数量之间的平衡是能否正确有效分析的关键因素之一，等位基因阈值设置的改变也会导致分析结果的不同[27]。尽管如此，分型能力强大的cg/wgMLST将会逐步取代传统的MLST分析在LM的分子流行病学研究中得以广泛应用。

2.4 单核苷酸多态性分析 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)分析是另一种基于细菌WGS数据的分型方法。SNP主要指在基因组水平上由单个核苷酸变异所产生的DNA序列多态性。SNP具有分辨率高、覆盖基因组范围大等特点，已被广泛应用于系统发育分析、群体遗传学研究和疾病相关基因等研究[28]。通过将目标菌株的基因组数据与参考基因组进行SNP比较并记录变化的核苷酸，能够揭示细菌群体的进化并发现和追踪暴发感染的来源[29]。Gilmour等首次对一起李斯特菌病暴发期间分离菌株的WGS数据进行SNP分析，确定了暴发菌株属于谱系II、CC8，并发现其非同义突变率较高的特点[30]。2017年1月1日至2018年7月17日南非发生了共1 060例病例的李斯特菌病暴发，Smith等利用SNP分析对病人和食品分离菌株进行系统发育分析，证实这次暴发的源头是Enterprise Foods公司生产的被LM污染的猪肉肠[31]。除此之外，Lüth等对德国十几年间发生的83例侵袭性李斯特菌病病例的LM分离株进行SNP聚类分析，推测这几起暴发感染的病例很有可能是由牲畜携带的LM所导致的[32]。

SNP分析需要较强的生物信息学分析能力，同时对菌株的WGS数据质量要求更高，需采用严格的质量标准，包括最小覆盖范围和SNP之间允许的距离等，以确保基因组数据的准确性和一致性。这些要求和标准会因基因组装方法的不同而有所差别，导致测序数据结果的差异，因而很难建立一致的命名法，由此给不同实验室间SNP分析的标准化带来了困难[33]。同时，在分离株分离和培养过程中产生的少量SNP的积累也会影响SNP分析时对菌株同源性的判断[34]。SNP分析具有对基因组数据精准至单个碱基的强大分析能力，因而在LM的分子流行病学研究中具备广阔的应用前景。

3 展 望

由LM引起的人和动物李斯特菌病致死率高、危害性大，尽管已采取相关的预防措施如建立食品安全监测网络对其进行防控，但仍有散发甚至暴发的李斯特菌病在各个国家和地区出现。近年来国内外对LM分子分型、流行病学、致病机制等的研究不断深入，为李斯特菌病的预防和控制提供了参考依据。基于WGS数据的cg/wgMLST和SNP分析方法具有分辨率高、可重复性强、高通量等特点，为病原菌的分子流行病学研究提供了有效手段，将会在LM的监测和预防控制中发挥重要作用。

利益冲突：无

引用本文格式：王 也，凌志婷，徐 尧，等. 单核细胞增生李斯特菌基于基因组学的分型和溯源技术研究[J].中国人兽共患病学报，2022，38(4)：327-330，340. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.033