食品组学技术应用于蜂胶成分鉴定

张文文 赵溪 张旭光,3,4 王凯 李强强 薛晓锋 吴黎明

（1 中国农业科学院蜜蜂研究所，100093；2 汤臣倍健股份有限公司科技中心；3 中国科学院上海营养与健康研究所，200000；4 深圳大学生命与海洋科学学院，518000）

1 蜂胶概述

蜂胶是蜜蜂采集外界多种树木的嫩芽分泌物或树木受伤部位分泌的树脂、泥土砂砾、蜜蜂蜂蜡以及蜜蜂的腺体分泌物混合形成的。通常，蜂胶是由50%～60%的树脂和香脂，30%～40%的蜡、5%～10%的精油、5%的花粉粒、微量元素和维生素组成[1]。在蜂巢中，被蜜蜂用来建造和修补巢穴、光滑巢壁、填补缝隙和抵御外界病原菌，防止微生物疾病的发生与传播及虫鼠的入侵，同时蜂胶作为一种天然产品受到广泛应用和关注。

1.1 蜂胶的化学成分

蜂胶有着十分复杂的化学成分，由上百种化合物组成，大量研究表明，不同植物源、蜜蜂所在当地气候的不同、采胶的时间以及蜜蜂种类的不同都会导致蜂胶的成分组成差异，随着现代分离、纯化以及鉴定技术的发展，如核磁共振（NMR）、气相色谱（GC）、薄层色谱、高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等，蜂胶中的化学成分被逐渐挖掘和发现，蜂胶中的主要成分有黄酮、酚酸、萜类、芳香酸、醇类、脂肪酸、矿物质、类固醇和糖等，其中酚酸和黄酮是蜂胶的主要活性组成成分，其含量的高低决定了蜂胶的质量[2]。

蜂胶中的黄酮化合物根据其化学结构的不同又可以分成11 个亚类，即黄烷、异黄烷、黄烷酮、黄烷醇、黄酮、异黄酮、异二氢黄酮、黄酮醇、查耳酮、二氢查耳酮和新黄酮。萜类使蜂胶具有特殊的树脂气味，是蜂胶中的主要挥发性成分，也是蜂胶中有效活性成分，因此也可以以此来简单的区分优质和劣质蜂胶以及假蜂胶，约占蜂胶总量的10%。蜂胶中分离出的萜类包括单萜、倍半萜、二萜和三萜类，其中单萜又分为无环、单环、二环单萜及其衍生物。倍半萜是蜂胶萜类中含量最丰富的，根据环的数量，倍半萜分为四类：无环，单环，双环和三环[3]。脂肪酸是蜂胶中的非极性部分之一，以糖苷，游离脂肪酸，不同类型的酯或其他形式存在于蜂胶中[4]。蜂胶中还含有蔗糖、果糖、葡萄糖等糖类物质，蜂胶中糖类的来源问题目前尚未得到彻底解决，有研究认为，蜂胶中的蔗糖、果糖和葡萄糖可能来源于蜂蜜或者蜜蜂采集的花蜜，还有研究认为，蜂胶中的糖可能是由蜂胶中的类黄酮糖苷分解产生的[5]。Cvek 等通过中子活化分析在不同的阿根廷蜂胶中鉴定出了Br、Co、Cr、Fe、Rb、Sb、Sm 和Zn[6]。

1.2 蜂胶的生物活性

据报道，蜂胶早在公元前300年就被世界许多地区的人们所发现并应用于医学中[7]。埃及人发现并利用了蜂胶的抗氧化和抑菌活性，用蜂胶来保存已故的尸体。到了中世纪，阿拉伯人用蜂胶来抑制伤口感染和作为口腔消毒剂[8]。

蜂胶复杂的化学成分组成与蜂胶的多种生物活性息息相关。蜂胶中肉桂酸和香豆素的存在产生杀菌作用，由于类黄酮和芳香酸衍生物的作用，蜂胶具有体外抗病毒活性（单纯疱疹，流感）、抗溃疡（帮助愈合）、免疫刺激、降压和抑制细胞等作用[9]。蜂胶中所含有的阿替匹林C、绿原酸、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、高良姜素、槲皮素以及黄酮等化合物都是具有强大的治疗潜能[10]。许多科学研究也报道了蜂胶的生物活性，有抗炎症[11]、抗肿瘤[12]、抗癌症[13]、抗真菌[14]、清除自由基[15]、免疫刺激等。蜂胶在生活中的多个行业领域都有应用，包括医学、保健品、化妆品等。

2 食品组学概述

近年来，食品组学研究取得了飞速的发展，这主要体现在先进的研究技术中，使食品组学的方法学研究在多个领域更加通用。食品组学研究可以用来分析食品的生物活性和食品中的活性成分、提供相关分子机制的新见解、探索和发现新的生物标记[16]。

2.1 基因组学

基因组学在食品组学技术中应用较早，涉及生物体内基因组基因的结构和功能基因的测序、组装和分析。基因组学的主要目的是为了了解生物学的组成部分，并通过实验和分析获得尽可能多的与生物学组成相关的遗传序列信息。基因组学研究所使用的技术中，用途最广泛的是高密度寡核苷酸或互补DNA 阵列技术。与DNA阵列技术相比，下一代DNA测序技术（NGS）可以同时（通常也叫做尽可能平行）处理数百万个测序反应，且无需序列库[17]，大大提高了DNA 序列信息获取的速度，并降低了测序成本。基因组学技术还包括单分子测序（也称为第三代测序系统），单分子测序技术的优势在于允许高密度单分子异步扩展，因此在化学动力学方面具有高度的灵活性[18]。

2.2 转录组学

转录组学是对一个细胞或者一组细胞的所有RNA 信息进行的研究，是了解基因组功能元件并揭示细胞分子组成的重要工具[19]。转录组学分析的两个主要工具分别是基因表达微阵列和RNA 大规模测序（RNA-Seq）。基因表达微阵列根据其设计可分为在固体平板基质（或微芯片）上的微阵列和在球形基质（或颗粒微阵列）上的微阵列[20]。RNA-seq 技术是基于新一代测序技术，并且有大量的测序平台，其目的是对整个转录组序列进行测序[21]，因此RNA-seq 技术可以应用于全基因组高通量转录组学。

2.3 蛋白质组学

食品蛋白质组学是指以应用食品蛋白质组学技术对特定生物食品系统中的蛋白质进行大规模分析，除了研究蛋白质的化学结构和功能外，蛋白质组学还研究蛋白质的修饰作用，蛋白质丰度的定量分析以及研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用[22]。蛋白质组学还致力于在特定时间和条件下，对生物系统中表达的蛋白质进行定性和定量分析。蛋白质组学的分析过程包括蛋白质的提取和分离，蛋白质消化成肽，质谱分析，蛋白质的定性和定量分析[23]。蛋白质组学分析中有两种蛋白质提取和分离技术，一种是二维电泳（2-DE）法，另一种是多维液相色谱法。2-DE 方法中蛋白质的提取和分离是基于等电点（pI）和在聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白质的分子质量分离，然后进行图像分析以对图像中所有可辨别的斑点进行分类，以为后续研究提供参考[24]。多维液相色谱技术可以通过与串联质谱联用的LC（LC-MS/MS）进行蛋白质的有效提取和分离。用来表征和分析蛋白质组学结果的工具主要是质谱分析，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）和电离子阱质谱（ESI-IT），这两种技术都是先将蛋白质电离，然后再通过MS 分析[25]。

2.4 代谢组学

代谢组学技术专注于小分子代谢物（＜1000-1500Da）的定性和定量研究，以比较样品之间的差异[26]。代谢组学分析的内容包括根据研究目的提取目标代谢物，选择分析仪器和准备样品，进行样品上机检测，获取相应的数据结果以及通过分析软件进行分析和鉴定，生物信息学和化学计量学是两种主要用于代谢组学数据分析的工具[27]。代谢组学的研究有靶向和非靶向两种方法，其中非靶向代谢组学又包括代谢谱和代谢指纹图谱。代谢组学技术中最常用的数据采集平台有核磁共振（NMR），气相色谱-质谱（GCMS），液相色谱-质谱（LC-MS） 和毛细管电泳质谱法（CE-MS）[28]。不同的组学技术分析各有其优势，各种代谢组学技术的组合应用可以获得互补的分析信息结果，从而使代谢组学技术的应用范围更广。

2.5 其他

食品组学还包括化学计量学，表观基因组学，生物信息学和MicroRNA（miRNA）等。化学计量学技术是代谢组学技术的一个分支，通过构建模型来识别和验证目标样品，识别和分类的方法主要包括非监督主成分分析（PCA），监督判别分析（DA），层次聚类分析（HCA）和类模拟的软独立建模（SIMCA）[29]。表观遗传学技术是指在表观遗传学水平上对基因状态变化进行全基因组分析[30]。全基因组分析主要是分析染色体的染色体结构变化，该染色体结构会影响相应基因的表达，从而影响相应位置的表观遗传状态[31]。生物信息学技术是对从各种组学技术中获得的数据进行深入探索，并通过功能注释，遗传和蛋白质数据进行聚类分析，最后阐述其生物学意义[32]。miRNA 是非编码RNA 的亚型，可通过mRNA 降解，mRNA 翻译和基因转录水平来调节基因的表达[33]。

3 食品组学技术在蜂胶成分研究中的应用

食品组学技术应用于蜂胶研究可以快速精确地对蜂胶的生物学来源、产地、类别以及蜂胶的化学成分、蜂胶的质量控制等进行有效的分析。Wang 等应用了一种可靠的基于1 H NMR 的代谢组学方法深入了解中国温带蜂胶（CWTP）和中国中温蜂胶（CMTP）的成分差异，共收集了63 个来自不同地区的相同植物源的中国蜂胶乙醇提取物进行分析，鉴定出21 种化合物，包括10 种类黄酮，9 种酚酸及其酯以及其他化合物，且研究发现，由于蜜蜂对相同植物来源所在不同气候地区的长期适应，造成了蜂胶的成分差异，并造成了蜂胶生物活性的差异[34]。Mouse 等通过HPLC/ESI-MS 研究了摩洛哥蜂胶提取物的化学成分，以及它们在体内和体外的抗癌潜力，结果表明，摩洛哥蜂胶提取物中含有几种黄酮类化合物，包括鼠李素，木犀草素和三氢西甲氧黄酮，一些类黄酮苷，如汉黄芩苷，槲皮素阿拉伯糖苷和山奈酚-O-葡萄糖苷，其抗癌活性不仅取决于蜂胶提取物所含有的化学成分，还取决于靶向的肿瘤细胞[21]。使用基于GC-MS 方法，Duran 等人研究两种土耳其蜂胶提取物的化学成分与抗利什曼虫药活性之间的关系，研究确定了提取物中的化合物，包括一些脂肪酸酯（油酸乙酯），肉桂酸酯（肉桂酸肉桂酸酯），碳氢化合物（十七碳烯，1-十七碳烯和1-十八碳烯）和倍半萜烯（δ-cadinene），这些化合物有助于土耳其蜂胶提取物具有对抗利什曼原虫的功效[22]。Barbaric 等通过RP-HPLC 鉴定并定量了20种乙醇提取的蜂胶样品中的酚酸和类黄酮，分别是阿魏酸、对香豆酸和柯因、高良姜素、芹菜素、松属素-7-甲醚、松属素、山奈酚[9]。Soltani 等应用GC-MS 检测技术基于峰面积和保留时间（RT）检测了四种来自阿尔及利亚塞提夫地区的蜂胶的化学成分，结果在水提取物和乙醇提取物中分别鉴定出20 多种化合物和30 至35 种化合物[11]。Okinczyc 等研究尼泊尔地区源于Apis mellifera L.和Trigona sp的两个蜜蜂属的蜂胶，通过HPLC-DAD-MS/MS 技术鉴定70%乙醇提取后提取物的化学成分，共检测出23 种化学成分，两种蜂胶提取物的成分几乎相同，主要成分为黄酮（主要是新类黄酮，异类黄酮）和紫檀素[12]。Ristivojević 等利用UHPLC-LTQ/Orbitrap/MS/MS 技术研究土耳其蜂胶中的化学成分，结果共定性定量了15 种化合物，包括2 种苯甲酸衍生物、5 种酚酸和3 种黄烷醇，3 种黄酮，1 种黄烷酮和1 种糖苷[13]。蜂胶中的酚酸和黄酮成分是其主要的生物活性成分，但是蜂胶中的酚酸黄酮的种类和含量受到当地气候和植物源的影响存在较大差异，Saftić 等建立了与三重四极杆结合的目标液相色谱法（LC-QQQ），与四极杆飞行时间结合的非靶向液相色谱法（LC-QTOF）和直接进样QTOF 法，分析了来自克罗地亚不同地理区域的56种蜂胶样品。分析结果表明，克罗地亚境内不只一种蜂胶类型，主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）表明，蜂胶样品中的多酚含量在地中海的影响下发生了显著变化，因此，在克罗地亚海岸，“欧洲”蜂胶类型与地中海型蜂胶混合，尤其是在岛屿上。对于蜂胶类型的快速筛查，直接进样QTOF 分析被证明是一种快速可靠的方法，但是对于酚类化合物的明确鉴定，色谱分离是必不可少的[35]。

4 总结

食品组学技术中应用于蜂胶研究，多是体现在对蜂胶成分、蜂胶的类别、蜂胶的起源地的鉴定，对于蜂胶的活性及机制研究的应用还比较少。因此，食品组学技术可以继续应用于蜂胶的活性研究，并从基因、蛋白、代谢通路等多个方面探究其主要活性成分和作用机制。