基于MPMS方法的黑木耳优良菌株选育

尹显达，刘敏，杨超上，张铁军，王谦

(1.河北大学 生物工程技术创新中心，河北 保定 071002；2.承德市农业环境保护监测站，河北 承德 067000)

黑木耳(Auriculariaauricula)又名木耳、云耳等，是一种重要的食药兼用真菌，属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)木耳目(Auriculariales)木耳科(Auriculariaceaes)木耳属(Auricularia)[1-2].黑木耳营养价值丰富，子实体中富含蛋白质、膳食纤维、氨基酸等营养成分以及钙、铁、锌等矿物质元素[3-4]，同时具有多种功能活性成分，如多糖、多酚、黄酮等[5-7],是中国广泛种植和消费的食药兼用真菌之一[8]，其产量在中国栽培食用菌中居于第2位[9].在国家脱贫攻坚及乡村振兴过程中,黑木耳发挥了重要作用，同时也成为了21世纪发展最快的食用菌，产业规模不断扩大，但菌种退化、优良菌种缺乏等问题严重影响了产业的发展，因此，优良菌种的选育就显得尤为重要.

多功能等离子体诱变系统(multifunction plasma mutagenesis system ,MPMS)是一种新型微生物诱变育种技术，通过氮气在电场作用下产生的等离子体使细胞的DNA或蛋白质结构发生改变，激活细胞自身修复体系，产生随机突变[10]. MPMS操纵简便，成本低，不产生有害气体，不造成污染，可以作为一种创新的育种手段. 本研究使用MPMS方法对黑木耳Aa66进行育种工作，通过筛选得到1株综合性能优良的诱变菌株.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出发菌株黑木耳Aa66，保藏于河北大学食药用真菌研究所.

1.1.2 栽培培养基

PDA斜面培养基：常规.

液体培养基：玉米粉5 g，豆饼粉5 g，葡萄糖25 g，酵母膏4 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，蒸馏水定容至1 L.

栽培培养基：杂木屑、玉米芯、麸皮、生石灰的质量分数分别为60%、20%、18%、2%.

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝体的制备

参照文献[11-12]制备菌丝体.

1.2.2 菌悬液的制备

参照文献[11-12]制备菌悬液.

1.2.3 MPMS诱变处理

无菌条件下，吸取30 μL菌悬液均匀涂抹至载片上，调整MPMS参数，参照文献[11-12]进行设置，每个时间设置6个平行.诱变结束后，用1 mL无菌水与处理液充分混匀，吸取适量液体涂布平板，培养6 ～8 d(25 ℃避光)，观察菌丝再生情况，计算致死率，绘制曲线，得到最佳诱变参数.在最佳诱变条件下重复实验，获得诱变菌株.

1.2.4 初筛

采用4点接种法对诱变菌株与出发菌株Aa66进行拮抗实验，记录产生显著拮抗反应的诱变菌株[13].

1.2.5 复筛

挑取直径在6 mm左右的诱变菌株菌丝块接入栽培培养基试管中，采用划线法观察菌株长势，计算生长速度[14].

取上述筛选到的诱变菌株和出发菌株Aa66，测定菌丝的半纤维素酶、羧甲基纤维素酶[15-16]和漆酶活性[17-18].

选取3种酶活均优于出发菌株Aa66的菌株及出发菌株Aa66，接种至预先灭菌的栽培袋中，避光培养，对前3茬木耳的质量进行称量，统计数据，进行生物学效率分析.

1.2.6 真实性鉴定

参考中国农业行业标准NY/T1730—2009[19]，使用ISSR法对优良诱变菌株与出发菌株Aa66进行真实性鉴定[20-21]，根据遗传距离确定其亲缘关系，运用软件Ntsys 2.10e进行聚类分析，构建遗传关系聚类树状图.

1.3 数据统计

数据采用SPSS进行分析.

2 结果与分析

2.1 MPMS致死率

由表1可知，致死率在50、60、70、80 s时分别为86.74%、93.07%、99.24%、100%，因此，最佳诱变时间确定为60 s，在此条件下进行诱变实验.

诱变实验后，共得到315株诱变菌株，依次编号为Y1、Y2、Y3、Y4、…、Y315.

表1 MPMS致死率

2.2 初筛结果

将诱变得到的315株诱变菌株与出发菌株Aa66进行拮抗实验，有29株与出发菌株Aa66形成明显拮抗，部分拮抗结果如图1所示.

图1 诱变菌株与出发菌株Aa66拮抗结果Fig.1 Antagonistic result between mutant strain and starting strain Aa66

2.3 复筛结果

2.3.1 诱变菌株长速长势对比

将初筛得到的29株诱变菌株与出发菌株Aa66长速长势进行对比，结果如表2所示.由表2可知，初筛得到的29株诱变菌株中，Y9、Y16、Y37、Y50、Y180、Y285、Y17和Y306菌丝浓白，长势良好，长速均优于出发菌株Aa66，其中Y9、Y16、Y37、Y50与出发菌株Aa66相比有显著性差异；Y9、Y16、Y37与出发菌株Aa66有极显著性差异；菌株Y9长速最快，为4.98 mm/d，较出发菌株Aa66提高了11.65%.

表2 诱变菌株和出发菌株Aa66长速长势对比结果

2.3.2 诱变菌株与出发菌株Aa66胞外酶酶活对比

2.3.2.1 葡萄糖标准曲线

采用DNS法在520 nm处测定吸光度，结果如表3所示，据此绘制葡萄糖标准曲线，如图2所示，线性方程为Y=0.397 6X-0.006,回归系数R2=0.997 8.根据标准曲线计算葡萄糖生成量，从而得出酶活(每min生成1 g葡萄糖为1个酶活单位).

表3 葡萄糖标准曲线OD520值

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Glucose standard curve

2.3.2.2 3种胞外酶的酶活对比结果

对8株诱变菌株的羧甲基纤维素酶、漆酶和半纤维素酶的酶活进行对比，结果发现，8株诱变菌株3种胞外酶酶活存在差异.由表4～6可知，菌株Y9、Y16、Y37、Y50、Y180和Y285的3种酶活均大于出发菌株Aa66，且具有显著性差异.菌株Y9表现最优，羧甲基纤维素酶、漆酶和半纤维素酶的酶活分别比出发菌株Aa66提高了21.62%、20.65%和6.54%.

表4 诱变菌株和出发菌株Aa66的羧甲基纤维素酶酶活对比结果

表5 诱变菌株和出发菌株Aa66的漆酶酶活对比结果

表6 诱变菌株与出发菌株Aa66的半纤维素酶酶活对比结果

2.3.3 诱变菌株与出发菌株Aa66的生物学效率对比

挑取6株3种胞外酶酶活均高于出发菌株Aa66的诱变菌株与出发菌株Aa66的生物学效率进行对比，结果如表7所示，诱变菌株Y9、Y37、Y16、Y50和Y180的生物学效率均优于出发菌株Aa66，菌株Y9、Y37、Y16与出发菌株Aa66有显著性性差异，且诱变菌株Y9生物学效率最高，达115.34%，较出发菌株Aa66提高了8.43%.

表7 诱变菌株生物学效率对比结果

2.4 菌株真实性鉴定结果

2.4.1 优良诱变菌株ISSR指纹图谱

挑选20条随机引物对筛选出的优良诱变菌株与出发菌株Aa66进行扩增，有10条引物效果较好，条带分散，清晰，大小均为100～2 000 bp，部分引物扩增结果如图3所示.

M.Marker;1.Aa66;2.Y180;3.Y16;4.Y50;5.Y9;6.Y37.引物从左到右依次为P2、P6、832图3 引物P2、P6和832对5种诱变菌株与出发菌株Aa66的ISSR扩增图谱Fig.3 ISSR amplification profiles of five mutant strains and the starting strain Aa66 by primers P2, P6 and 832

2.4.2 遗传关系分析

采用Ntsys 2.10e软件分析5株优良诱变菌株Y9、Y16、Y37、Y50、Y180与出发菌株Aa66的亲缘关系，结果如图4所示，5株诱变菌株与出发菌株Aa66的遗传系数为0.457～0.833，说明在分子水平上存在不同程度的差异.当遗传变异系数在0.669时，可以把诱变菌株与出发菌株Aa66分成3大类群：一类是Aa66、Y180和Y37；一类是Y50；一类是Y16和Y9.诱变菌株Y16和Y9与出发菌株Aa66亲缘关系最远，在分子水平上存在变异.

图4 优良菌株与出发菌株Aa66遗传关系聚类分析Fig.4 Cluster analysis of genetic relationship between elite strains and starting strain Aa66

3 讨论

MPMS诱变技术在细菌、放线菌上早有应用，在食药用真菌领域的应用目前还相对较少，在黑木耳诱变育种中的应用暂未见报道.通过MPMS诱变技术选育黑木耳优良菌株，不仅操作简便，结果直观，大大缩短了育种时间，而且不产生有害气体，不造成污染，是一种节能环保、安全高效的新型育种手段.

实验采用MPMS诱变育种技术，确定最佳诱变时间为60 s，共获得315株诱变菌株，通过拮抗实验筛选出29株诱变菌株.复筛得到5株菌丝长势良好，生长速度、酶活和生物学效率显著高于出发菌株Aa66的诱变菌株(Y9、Y37、Y16、Y50和Y180)，其中Y9最优，其菌丝长速、生物学效率分别为4.98 mm/d、115.34%，较出发菌株Aa66提高11.65%和8.43%，羧甲基纤维素酶、漆酶和半纤维素酶酶活分别比出发菌株Aa66提高了21.62%、20.65%、6.54%，结果表明，MPMS在黑木耳育种中具有较大的潜力，可以作为一种选育优良黑木耳菌株的新方法.

经ISSR分析可知，诱变菌株Y9是与出发菌株Aa66不同的优良变异菌株，目前已经在河北省食用菌产业黑木耳综合实验站示范，进一步证明了该方法的可行性.