一种新型复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺对松材线虫毒力药效*

倪安顺 王永春 杨 丹 孙学书 叶建仁

(1.南京林业大学林学院 南方现代林业协同创新中心 南京 210037； 2.杭州益森键生物科技有限公司 杭州 311100)

松树萎蔫病又称松材线虫病，是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一种系统侵染性病害，能短时间造成松属(Pinus)树种大量萎蔫死亡。该病害起源于北美，目前主要分布在加拿大、墨西哥、美国、中国、日本、韩国、葡萄牙和西班牙等(王曦茁等， 2018)，亚洲是受松材线虫病影响最严重的地区。我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病(孙永春， 1982)，目前已扩散至全国19个省、731个县级行政区，发生面积已超过180万hm2，探寻有效的防病措施已经迫在眉睫。

松材线虫病的防控途径目前主要有检疫、监测、疫木除治、媒介昆虫防治、树干注射预防等(叶建仁， 2019)，其中树干注射预防因简便高效，有持效性等优点，应用面积愈来愈大，已经成为当前防治松材线虫病的重要手段之一。树干注射的有效性主要依赖于化学药剂在树木木质部的移动(Navarroetal.， 1992)，化学药剂在树体内的运输依靠水的流动，化合物的水溶性对其防治效果尤为重要(Takaietal.， 2001)。目前，用于树干注射预防的化学药剂主要是甲维盐和阿维菌素，在21 ℃时的水溶性只有10μg·L-1(Cabreraetal.， 2013)，水溶性差可能是制约它们在树体内发挥作用的一个重要因素，长期使用甲维盐和阿维菌素也容易使松材线虫产生抗药性 (Zhaoetal.， 2006)。因此，亟需寻找新的、更加有效的杀线剂应用于松材线虫病的预防实践。

氟吡菌酰胺(Fluopyram)是吡啶类杀菌剂，通过抑制琥珀酸脱氢酶的电子转移而抑制线粒体呼吸，具有广谱性和内吸性，可防治真菌病原菌引起的菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)、白粉病(Erysiphegraminis)和霜霉病(Peronosporaaestivalis)等(Labourdetteetal.， 2010)。近年来，拜耳作物科学公司发现氟吡菌酰胺还具有优良的杀线虫活性，并在2015年登记该药剂在杀线虫方面的应用(杨子辉等， 2017)。研究发现，氟吡菌酰胺对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、小麦孢囊线虫(Heteroderaavenae)、肾型肾状线虫(Rotylenchulusreniformis)具有良好的杀线效果(迟元凯等， 2019； Faskeetal.， 2015)，但是该药剂对于松材线虫的作用效果研究报道却极少。此外，氟吡菌酰胺在20℃时的水溶性为16 mg·L-1(杨子辉等， 2017)，远高于甲维盐和阿维菌素(10μg·L-1)，更易被树体吸收运输，有望成为一种良好的树干注射预防松材线虫新药剂。

不同药剂复配使用是延缓线虫抗药性和提高药效的一个重要途径。本研究通过对比2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺复配药剂与5%氟吡菌酰胺、5%阿维菌素单独施用对于松材线虫的生长繁殖的影响，来探究2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺作为一种新型复配杀线剂在防治松材线虫病方面的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫源： 试验线虫为南京林业大学森林保护实验室保存的松材线虫强毒力虫株AMA3虫株。

供试药剂： 5%氟吡菌酰胺(自配)，5%阿维菌素(自配)，2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺(自配)。

1.2 试验方法

1.2.1 不同药剂对松材线虫室内毒力测定 采用浸虫法探究3种药剂对松材线虫的室内毒杀效果。用贝尔曼漏斗法收集培养在灰葡萄孢菌上的松材线虫，3 500 r·min-1离心3min，沉淀经无菌水冲洗3次，配制成约为2 500条·mL-1线虫液。用无菌水将3种供试药剂分别稀释为5个质量浓度梯度，每个质量浓度为1个处理，每个处理重复3次，以无菌水作为空白对照。将药剂与虫液体积比1∶9混合加入1.5 mL离心管中，将所有离心管置于 25℃恒温培养箱中，24 h 后在显微镜下观察并计算松材线虫的存活与死亡数。将药剂浸泡24 h的松材线虫用无菌水冲洗3次，后置于无菌水中在25℃恒温培养箱静置24 h，观察线虫复苏情况。

对照死亡率(%)=对照死亡数/对照供试虫数×100；

校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)/

(1-对照组死亡率)×100。

由于线虫存在假死现象，可对呈僵直、“C”形或“J”形的线虫用昆虫针反复刺激，若仍僵直不动，则可判定死亡(龙鼎新等， 2006)。

1.2.2 种群繁殖量的测定 将灰葡萄孢培养 5～7 天后，采用喷雾法用显色喷雾器均匀喷施0.5 mL质量浓度为亚致死浓度LC20的药剂，对照组加喷无菌水。每皿接入约400条松材线虫，置于 25℃恒温培养箱培养。待对照培养皿中的灰葡萄孢被吃完后即全部停止培养，采用贝尔曼漏斗法分离各皿中的松材线虫，将虫液定容至一定体积，摇匀后吸取 100μL 置于载玻片上，微微加热至线虫死亡，在显微镜下观察并统计数量，计算不同处理中各个重复的线虫总数。每种处理设3个重复。因氟吡菌酰胺是杀菌剂，再设一不接松材线虫的对照组，加喷复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺，观察对灰葡萄孢抑菌效果。

1.2.3 松材线虫卵的收集与测定 将培养在灰葡萄孢上的松材线虫用贝尔曼漏斗法漏2 h，收集到15 mL离心管内，3 500 r·min-1离心3min，去上清。用无菌水清洗2～3遍，加无菌水配制成一定浓度的线虫悬浮液。取适量松材线虫悬浮液于3cm培养皿内，放到 25℃恒温培养箱培养8～12 h，产生大量的松材线虫卵粒并黏附在培养皿底部，将悬浮液连同松材线虫一起轻轻倒掉，用无菌水冲洗 3～4 次，即可收集获得松材线虫卵粒。将培养得到的松材线虫卵置于1.0、1.5、2、2.5和3.0 mg·L-15个不同质量浓度药剂中，分别于24 h和48 h 后，用显微镜观察并记录卵的孵化情况，每个处理3次重复。

孵化率=(松材线虫幼虫数/

松材线虫幼虫与卵总数)×100。

1.2.4 卵形态观察 药剂处理24 h后，在光学显微镜下，用移液枪将药剂浸渍下的松材线虫卵挑出放置在载玻片上，滴水润湿后加上盖玻片，利用蔡司荧光显微镜观察挑出的松材线虫卵形态结构。

1.2.5 温度梯度试验 将复配药剂用无菌水稀释为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg·L-15个质量浓度，置于温度梯度培养箱中，在15、20、25、30、35℃条件下，24 h 后在显微镜下观察并计算松材线虫的存活与死亡数。

1.3 数据处理

采用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，检测其显著差异性。用 Abbott 公式校正处理组死亡率。用 DPS 软件和机率值分析法对药剂进行毒力回归分析，计算LC20值、LC50值及其95%置信限。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对松材线虫毒力效果

不同药剂在不同质量浓度下对松材线虫的致死力见表1。3种药剂中，复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺的室内杀线效果最好，LC50值为2.020 8 mg·L-1，LC20值仅在0.447 9 mg·L-1; 其次是5%氟吡菌酰胺，LC50和LC20值分别是21.607 1和8.558 2 mg·L-1; 5%阿维菌素的杀线效果明显较前2个药剂弱，LC50和LC20浓度值分别达到51.153 6 和12.031 8 mg·L-1。

松材线虫药剂处理24 h后在无菌水中复苏24 h结果见表2。2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺、5%阿维菌素、5%氟吡菌酰胺的LC50值分别为2.152 2、55.705 5和22.763 2 mg·L-1，与药剂处理24 h结果相近(表2)。

表1 不同药剂对松材线虫毒力分析(24 h)

表2 松材线虫复苏24 h后LC50变化(48 h)

2.2 不同药剂对松材线虫繁殖取食影响

在药剂处理6天后，对照组1中各培养皿中的灰葡萄孢均已被松材线虫取食完，但药剂处理组中还可看到灰葡萄孢(图 1)，且单加喷复配药剂未对灰葡萄孢产生影响(对照组2)。其中，5%氟吡菌酰胺处理组和复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺处理组无明显差异(P=0.31)，其余各组间的种群数量差异均达显著水平(P<0.05)(图2)。复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺对松材线虫种群数量的抑制作用最明显，其次是5%氟吡菌酰胺，抑制效果相对最差的是5%阿维菌素，3种药剂处理后的每皿松材线虫种群数量分别为 (1 425±250)、(1 675±377) 和 (10925±504)条，而对照组线虫数量均大于每皿20000条。

本试验测定松材线虫种群繁殖速率(pf/pi)，结果显示，对照处理组具有较高繁殖速率(50.75)，5%阿维菌素处理组具有中等繁殖速率(27.31)，5%氟吡菌酰胺处理组和复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺处理组繁殖速率较低，分别为4.19和3.56(图2)。

图1 不同药剂处理6天后培养皿内灰葡萄孢被松材线虫取食面积

图2 不同药剂亚致死浓度LC20处理对松材线虫种群繁殖量和繁殖速率影响

2.3 不同药剂对松材线虫卵孵化率影响

不同药剂在处理24 h和48 h后对松材线虫卵孵化率的影响见图3。在24 h时，松材线虫在2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg·L-1共5个质量浓度的孵化率分别是73.37%、62.23%、42.19%、34.55%、20.32%；5%阿维菌素5个质量浓度处理时孵化率分别为83.22%、51.87%、39.62%、27.44%、21.36%； 在5%氟吡菌酰胺5个质量浓度处理时孵化率分别为52.58%、45.00%、36.42%、28.25%、22.89%，均远低于对照组93.88%。48 h时，卵孵化率均上升，且质量浓度越低，上升越明显。在质量浓度1 mg·L-1时，对松材线虫卵孵化抑制效果5%氟吡菌酰胺>2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿维菌素； 在质量浓度3 mg·L-1时，对松材线虫卵孵化抑制效果为2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿维菌素>5%氟吡菌酰胺。

在不同药剂10 mg·L-1处理24 h后卵的形态变化见图4，对照组松材线虫卵基本已孵化为二龄幼虫，药剂处理组卵孵化率均较低。在10 mg·L-1时，复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺处理组松材线虫卵内形成多个液泡与空洞，卵死亡，其他2种药剂处理组卵虽未孵化，但卵内未形成液泡，卵未死亡。

图3 不同药剂对松材线虫卵孵化率的影响(24 h、48 h)

图4 不同药剂10 mg·L-1处理24 h后卵形态变化

2.4 不同温度下2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺对松材线虫致死效果

不同温度条件下复配药剂对松材线虫致死效果见图5，在15、20、25、30、35℃条件下复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺的LC50分别为3.644 7、2.959 5、2.020 8、1.850 8、1.744 1 mg·L-1。同一质量浓度下，随着温度升高，松材线虫的死亡率增加。

图5 不同温度下2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺对松材线虫致死效果

3 讨论

3.1 复配药剂增效作用

阿维菌素为一种常用的松材线防治剂(谈家金等， 2003； Sousaetal.， 2013)，它可以作为树干注射剂来预防松材线虫，单次注射持效期可达2年(Lietal.， 2016)。氟吡菌酰胺作为一种新型杀线药剂对松材线虫作用效果的研究较少，在2020年首次报道其对松材线虫具有与阿维菌素类似的作用效果(Liuetal.， 2020)，笔者通过预试验也证实了氟吡菌酰胺具有良好的杀线效果。将不同药剂复配通常会对杀线活性具有增效作用(覃贵勇等， 2018)，将阿维菌素与氟吡菌酰胺复配对松材线虫的生长繁殖影响还未有人研究，本研究发现复配药剂2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺具有良好的杀线效果，其杀线活性远高于氟吡菌酰胺和阿维菌素单一药剂。

在室内杀线虫试验中，3种药剂杀线效果以2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺>5%氟吡菌酰胺>5%阿维菌素，其致死中浓度(LC50)分别为2.0208、21.6071、51.1536 mg·L-1，本试验测定出的各药剂的致死浓度相较于前人的研究结果(Zhangetal.， 2017)略偏高，这可能与所用松材线虫虫株不同有关，本研究选用的试验虫株AMA3鉴定为1株强毒松材线虫虫株，该虫株与我国不同地区收集虫株相比，其繁殖力与致病力都更高(朱丽华等， 2017)，繁殖力强可能使得该虫株对药剂的抗性更强，从而使得致死中浓度偏高。氟吡菌酰胺具有良好的杀线效果，这与前人研究一致(Liuetal.， 2020)。本试验表明，氟吡菌酰胺与阿维菌素的复配大大增强了杀线效果，具有良好的防治松材线虫病的应用前景。

3.2 药剂对松材线虫繁殖产卵影响

在繁殖量试验中，仅在亚致死浓度LC20条件下，3种药剂就均对松材线虫繁殖取食产生显著影响，这证实了Bi等(2015)的研究成果，其中氟吡菌酰胺和复配药剂抑制效果显著，2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺在质量浓度0.447 9 mg·L-1质量下就严重抑制了松材线虫的繁殖，阿维菌素对松材线虫繁殖量抑制效果较差，这可能是因为阿维菌素的长期应用使得松材线虫已产生抗药性(Zhaoetal.， 2006； 周利娟等， 2011)的所致。

在松材线虫卵孵化率试验中，3种药剂均能显著抑制松材线虫卵的孵化，这与前人研究一致(Liuetal.， 2020； Qietal.， 2006)，3种药剂整体对卵孵化抑制效果相近，在质量浓度3 mg·L-1质量下，24 h后2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺处理组卵孵化率仅为20.32%，说明该复配药剂在较低质量浓度下对松材线虫卵孵化仍有良好的抑制效果。2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺处理后松材线虫卵内形成液泡可能是因为高质量浓度药剂破坏了卵细胞的渗透屏障，卵细胞破裂死亡，Rajasekharan等(2017)研究发现5-碘吲哚醌处理松材线虫卵后也具有类似的作用。

3.3 温度对松材线虫抗药性影响

温度对松材线虫的生长繁殖影响很大，松材线虫的生长最适温度为25℃，低于10℃则不能完成生长发育，大于28℃时繁殖被明显抑制，大于33℃时不能繁殖(季英超等， 2021)，在不同温度下，药剂对松材线虫的毒杀效果不同，笔者通过试验发现随着温度的升高，2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺杀线效果增强，且在25℃之前，每增加5℃杀线活性提升更快，这可能是因为随着温度的升高，松材线虫新陈代谢更旺盛，而低温条件下松材线虫会进入滞育状态，脂肪相对积累率显著上升(王博文等， 2017)，这使得松材线虫对与药剂处理的敏感性下降，存活率上升。

综上所述，该复配药剂可能具有良好的防治松材线虫病的潜力，但2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺作为树干注射处理防治松材线虫的实际应用效果尚需进一步研究，如需要田间接种试验观察松树存活情况、药剂在树体内持效期等。

4 结论

对比3种不同杀线药剂的室内杀线效果、对松材线虫繁殖量和卵孵化率等抑制作用发现，2%阿维菌素·6%氟吡菌酰胺作为一种新型复配杀线药剂，对松材线虫具有较强的抑制效果，温度越高，杀线虫效果越好。