射干总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

王倩，康钰溥，杨利博，王乃泽，赵敏，武玉翠*

（1.河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056038；2.河北交通职业技术学院，河北 石家庄 050035）

射干〔Belamcanda chinensis（L.）DC.〕为鸢尾科属多年生草本植物，味苦，性寒，具有清热解毒、利咽消痰、散血消肿的功效[1～3]。射干含有丰富的异黄酮类化合物和三萜类化合物，在临床医药上应用逾显广泛，多用于喉痹咽痛、上呼吸道感染等疾病的治疗[4，5]。研究显示，从射干根茎中分离得到的黄酮类成分含量较高且稳定，具有较强的抗氧化作用[6，7]。以往对射干的研究多集中在根茎部黄酮类成分，而对其地上部黄酮含量及抗氧化活性的研究较少。为了探究射干地上部的药用价值，采用超声辅助正交试验优化提取工艺，对射干各部位的总黄酮含量进行比较，并对其抗氧化性进行评价，旨为射干的高效利用提供一定的理论依据和技术参考[8～10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物试材为人工栽培的射干，2020年9月中旬采自邯郸市涉县，带回实验室后，将其须根、主根、花梗、叶、花、茎分开，分别置于烘箱内55℃烘干至恒重，晾凉后粉碎并过60目筛，粉末装密封袋中，备用。

主要仪器有LDO-101-1系列电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）、YB-1000A型多功能药物粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）、奥豪斯Adventurer AX系列万分之一电子天平（美国）、KQ-100DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）、Thermo ST8 ST8R热电高速冷冻离心机（美国）和普析TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

主要药剂有芦丁标准品（质量分数＞99%）、2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2，2′-联氨-双二胺盐（ABTS）、奎诺二甲基丙烯酸酯（水溶性维生素E，Trolox）、无水乙醇、甲醇、NaNO2、AlCl3、NaOH、甲醇和丙酮，均为分析纯，除芦丁标准品、DPPH、ABTS和Trolox购于美国Sigma公司外，其他药剂均为国产。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品10.0 mg，用60%乙醇溶液配制成浓度为1.0 mg/mL的标准芦丁母液；而后用去离子水将其依次稀释成浓度为0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.01 mg/mL的系列梯度溶液。取稀释后各梯度溶液500 μL于10 mL离心管中，依次加入60%乙醇溶液4 mL、5%的NaNO2溶液100 μL，充分混匀后室温静置6 min；再加入10%的AlCl3溶液，混匀后室温静置6 min，使其逐渐变色；最后加入4%的NaOH溶液300 μL，摇匀，室温下显色反应10 min。以60%乙醇溶液为空白校正，采用紫外可见分光光度法于波长510 nm处测定吸光度。以吸光度（Y）对芦丁浓度（mg/mL，X）进行线性回归，得到芦丁浓度—吸光度标准曲线方程。

1.2.2 射干总黄酮的提取方法 称取射干样品粉末100.0 mg，加入提取溶剂2 mL，在一定的料液比、提取温度和超声功率条件下进行提取，然后5 000 r/min离心3 min，将上清液移至另一离心管；残渣复提1次。将2次上清液合并为样品提取液，按照1.2.1方法测定吸光度。依据线性回归方程，计算样品的总黄酮含量。

1.2.3 单因素条件的筛选（单因素试验） 在其他因素固定的条件下，变化某个因素水平，以总黄酮含量为考察指标，对单因素的适宜条件进行筛选。每处理均3次重复。

1.2.3.1 提取溶剂的确定。精密称取射干粉末100.0 mg置于10 mL离心管中；加入提取溶剂2 mL，试验提取溶剂种类设甲醇-丙酮（体积比为7∶3）、60%乙醇、70%乙醇和70%甲醇4个处理；在温度40℃、超声功率60 W条件下提取0.5 h。

1.2.3.2 乙醇浓度的确定。精密称取射干粉末100.0 mg置于10 mL离心管中；加入不同浓度的乙醇2 mL，试验乙醇浓度设60%、70%、80%和90%计4个处理；在温度40℃、超声功率60 W条件下提取0.5 h。

1.2.3.3 料液比的确定。精密称取射干粉末100.0 mg置于10 mL离心管中；加入不同数量的70%乙醇，试验加入量设1.0 mL〔料液比（m∶V）1∶10〕、1.5 mL（料液比1∶15）、2.0 mL（料液比1∶20）、2.5 mL（料液比1∶25）和3.0 mL（料液比1∶30）5个处理；在温度40℃、超声功率60 W条件下提取0.5 h。

1.2.3.4 提取温度的确定。精密称取射干粉末100.0 mg置于10 mL离心管中，加入70%乙醇2 mL；在不同温度下超声功率60 W提取0.5 h，试验提取温度设40、50、60、70和80℃计5个处理。

1.2.3.5 超声功率的确定。精密称取射干粉末100.0 mg置于10 mL离心管中，加入70%乙醇2 mL；在温度70℃下采用不同的超声功率提取0.5 h，试验超声功率设60、70、80、90和100 W计5个处理。

1.2.4 提取条件的优化（正交试验） 根据单因素试验结果，确定正交试验设计的因素与水平。按照正交表进行试验设计，以总黄酮含量作为考察指标，对射干总黄酮的提取条件进行优化。

1.2.5 射干总黄酮抗氧化活性试验 采用优化后的提取条件，对射干不同部位的总黄酮进行提取；然后，进行射干不同部位总黄酮的抗氧化活性试验。

1.2.5.1 对DPPH自由基的清除效果。参考李洁等[11]方法，精确称取DPPH 1.0 mg，用甲醇将其充分溶解并定容至100 mL的容量瓶中，得到浓度为0.001%的DPPH反应溶液，避光保存，备用。以提取液中所含材料的质量浓度为单位，分别将样品提取液稀释成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的溶液；分别取各浓度梯度的样品溶液200 μL，加入DPPH反应溶液1.2 mL，摇匀后室温避光静置30 min，在波长517 nm处测得反应液的吸光度（A样品），同时将甲醇反应液的吸光度作为空白（A空白），取3次重复的平均值。根据公式，计算出各部位不同浓度下样品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=（1-A样品/A空白）×100%

以样品浓度为自变量、DPPH清除率为因变量做图并进行线性拟合，计算出不同浓度下样品自由基清除能力的IC50。

1.2.5.2 对ABTS+自由基的清除效果。参考荆常亮[12]方法，精密称取ABTS 384.076 mg，用蒸馏水定容至100 mL的容量瓶中，配制成浓度为7 mmol/L的ABTS溶液。称取K2S2O866.284 mg，用蒸馏水定容至100 mL的容量瓶中，配制成浓度为2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液。将上述2种溶液各取10 mL混合均匀，室温避光条件下放置12～16 h，得到ABTS+工作液母液。用适量的无水乙醇将其稀释至波长734 nm处吸光值为0.7±0.02的溶液，制成ABTS+工作液。以Trolox为标准品，用无水乙醇稀释成浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21和0.24 mg/mL的标准品溶液。分别取上述各浓度标准品溶液0.1 mL，加入ABTS+工作液4 mL，室温下避光反应6 min，在波长734 nm处测定吸光度（A样品），同时将蒸馏水反应液作为空白（A空白）。根据公式，计算ABTS+自由基清除率：

ABTS+自由基清除率=（1-A样品/A空白）×100%

以Trolox浓度（X）为横坐标、ABTS+自由基清除率（Y）为纵坐标，得到线性回归方程。将待测样品提取液稀释4倍，测得ABTS+自由基清除率；然后带入方程，计算得出相对于Trolox含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

以吸光度（Y）对芦丁浓度（X）进行线性回归，得到二者的关系方程为y=1.029 5X-0.001 8，r2=0.999 9。说明芦丁浓度在0.01～0.5 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 单因素条件的筛选（单因素试验）

2.2.1 提取溶剂的筛选 不同溶剂提取的射干总黄酮含量差异较大，其中70%乙醇处理的总黄酮含量最高，且与其他溶剂处理差异均达到了显著水平（图1）。表明最佳的提取溶剂为70%乙醇。

图1 提取溶剂种类对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of extraction solvents on total flavonoids content

2.2.2 乙醇浓度的筛选 随着乙醇浓度的增大，射干总黄酮含量呈先增加后降低的变化，其中80%浓度处理的总黄酮含量最高，70%浓度处理次之，二者差异不显著，但均与其他2个浓度处理差异达到了显著水平（图2）。表明适宜的乙醇浓度为70%～80%，其中70%较为经济。因此，选择乙醇浓度70%进行下一步的正交试验。

图2 乙醇浓度对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids content

2.2.3 料液比的筛选 随着乙醇用量的增大，射干总黄酮含量呈先增加后降低的变化，但不同用量处理的指标值差异均不显著，其中2 mL用量处理的总黄酮含量最高（图3）。表明适宜的料液比为1∶（10～30），综合来看料液比为1∶20效果最好。因此，选择料液比为1∶20进行下一步的正交试验。

图3 料液比对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of material liquid ratio on total flavonoids content

2.2.4 提取温度的筛选 随着提取温度的升高，射干总黄酮含量呈先增加后降低的变化，其中70℃处理的总黄酮含量最高，且与其他温度处理差异均达到了显著水平（图4）。表明最佳的提取温度为70℃。因此，选择提取温度70℃进行下一步的正交试验。

图4 提取温度对总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids content

2.2.5 超声功率的筛选 随着提取功率的增大，射干总黄酮含量呈逐渐增加趋势，其中90 W与100 W功率处理的总黄酮含量差异不显著，但二者均与其他3个功率处理差异达到了显著水平（图5）。表明适宜的超声功率为90～100 W，考虑到操作的安全性，认为90 W效果较好。因此，选择超声功率90 W进行下一步的正交试验。

图5 超声功率对总黄酮含量的影响Fig.5 Effect of ultrasound power on total flavonoids content

2.3 提取条件的优化（正交试验）

根据单因素试验结果，将乙醇浓度、料液比、提取温度、超声功率4个因素作为考察对象，按照L9（34）正交表进行正交试验设计（表1）。结果（表2）显示，4个因素的R（极差）顺序为B＞D＞C＞A，表明料液比对射干总黄酮含量影响最大，其次是超声功率和提取温度，乙醇浓度对射干总黄酮含量影响最小；9个试验组合的总黄酮含量为6.90～9.54 mg/g，组合间差异较大，其中A1B2C2D2组合的指标值最高，表明射干总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取温度70℃、超声功率80 W。

表1 正交试验设计的因素及其水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experimental design

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 射干不同部位总黄酮的抗氧化活性

2.4.1 射干不同部位的总黄酮含量 射干须根、主根、花梗、叶、花、茎的总黄酮含量分别为9.81、9.38、6.03、12.30、11.12和1.37 mg/g，指标值顺序为叶＞花＞须根＞主根＞花梗＞茎，其中叶的总黄酮含量显著＞其他部位（图6），约为茎总黄酮含量的8.98倍。表明射干不同部位的总黄酮含量差异较大，其中叶的总黄酮含量明显高于其他部位。

图6 射干不同部位的总黄酮含量Fig.6 Contents of total flavonoids in differentparts of B.chinensis

2.4.2 射干不同部位总黄酮对自由基的清除效果

2.4.2.1 对DPPH自由基的清除效果。随着提取物黄酮浓度的增大，DPPH自由基清除率普遍呈逐渐增大趋势；但相同浓度下，射干不同部位提取物对DPPH自由基的清除效果存在一定差异（图7）。黄酮浓度为0.2～0.8 mg/mL时，所有部位提取物的DPPH自由基清除率均快速升高，其中黄酮浓度为0.8 mg/mL时须根、主根、花梗、叶、花、茎提取物的DPPH自由基清除率分别为65%、32%、69%、57%、70%和11%；增大黄酮浓度，除须根的DPPH自由基清除率变化甚微外，其他部位提取物的DPPH自由基清除率均继续升高，其中黄酮浓度为1.4 mg/mL时须根、主根、花梗、叶、花、茎提取物的DPPH自由基清除率分别为65%、60%、92%、90%、96%和17%，其中花的DPPH自由基清除率约为茎的5.65倍。在试验浓度范围内，射干须根、主根、花梗、叶、花、茎提取物对DPPH自由基清除的IC50分别为0.59、1.17、0.48、0.65、0.50和6.68 mg/mL。花梗提取物的IC50最低，说明花梗对DPPH自由基的清除能力最好。

图7 射干不同部位提取物的DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

2.4.2.2 对ABTS+自由基的清除效果。以质量浓度（X）为横坐标、ABTS+自由基清除率（Y）为纵坐标，得到Trolox浓度对ABTS+自由基清除率的回归方程为Y=377.96X＋8.429 4，r2=0.999。说 明Trolox浓 度 与ABTS+自由基清除率之间线性关系良好，且所得数据较为可靠。

射干不同部位提取物的ABTS+自由基清除率顺序为须根＞叶＞花＞主根＞花梗＞茎，除茎外，其他各部位提取物均对ABTS+自由基表现出较高的清除能力（图8）。其中，须根提取物的清除率为97.98%，与叶提取物的清除率（96.90%）差异不显著，但二者均与其他部位提取物的清除率差异达到了显著水平，说明射干须根和叶的提取物对ABTS+自由基具有很好的清除作用；花提取物的ABTS+自由基清除率居第3位，达到92.75%，为茎清除率的7.17倍。

图8 射干不同部位提取物的ABTS+自由基清除率Fig.8 ABTS+free radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

待测样品溶液稀释4倍后，射干不同部位ABTS+自由基清除能力相对于Trolox含量具有显著差异，指标值顺序分别为须根（9.5 mg/g）＞叶（9.04 mg/g）＞花（8.95 mg/g）＞主根（8.42 mg/g）＞花梗（5.66 mg/g）＞茎（0.73 mg/g）（图9）。说明提取物对ABTS+自由基的清除率越高，相对于Trolox含量也越高。

图9 射干不同部位ABTS+自由基清除能力相对于Trolox的含量Fig.9 ABTS+free radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

2.4.3 射干总黄酮含量与其抗氧化活性的相关分析 射干不同部位的DPPH自由基清除率与其总黄酮含量的线性回归方程为Y=5.504 1X+21.978，R2=0.565 1（p＞0.05）（图10），表明二者相关不显著；ABTS+自由基清除率与其总黄酮含量的线性回归方程为Y=5.2246X+13.765，R2=0.937 6（p＜0.01）（图11），表明二者相关性较好。

图10 射干不同部位的DPPH自由基清除率与其总黄酮含量的相关性Fig.10 Correlation between DPPH free radical scavenging rate and total flavonoids content in different parts of B.chinensis

图11 射干不同部位的ABTS+自由基清除率与其总黄酮含量的相关性Fig.11 Correlation between ABTS+free radical scavenging rate and total flavonoids content in different parts of B.chinensis

3 结论与讨论

采用超声辅助提取射干总黄酮，在单因素试验的基础上，采用正交试验法对射干总黄酮的提取条件进行优化，得到最佳提取条件为乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取温度70℃、超声波功率80 W；然后，采用优化后的提取条件，对射干不同部位的总黄酮含量进行测定，结果显示，射干各部位的总黄酮含量为1.37～12.30 mg/g，部位间差异较大，其中叶的总黄酮含量最高、茎的总黄酮含量最低，最高含量是最低含量的8.98倍。与单因素试验结果稍有不同，本研究采用正交试验将最佳提取参数组合起来，使得射干总黄酮提取更加完全。冯传卫等[13]采用正交优化法确定了射干总异黄酮的最佳提取条件，认为正交优化法较单因素试验提取效果好，且乙醇浓度、乙醇用量和提取时间对射干总异黄酮提取率的影响显著。目前，常见的总黄酮提取方法有传统水浴提取法和超声波提取法，其中，超声波提取法利用超声波的振动等作用，使组织的细胞破裂，加速细胞中成分的溶解，与水浴法相比极大地节约了时间，且提高了有效成分的提取率[14-16]。李森林[17]在研究射干异黄酮类化合物的分离中采用超声辅助提取法，避免了物质在高温条件下失活，此工艺耗时短，是一种简单易行的提取方法。另外，本研究中利用DPPH和ABTS+自由基清除率指标，进一步对射干不同部位提取物的抗氧化性进行了比较，结果显示，射干不同部位提取物对2个自由基的抑制能力存在着一定差异。其中，花梗提取物对DPPH自由基的清除能力最强，IC50为0.48 mg/mL，但花梗总黄酮含量（6.03 mg/g）与其他部位（须根9.81 mg/g，主根9.38 mg/g，叶12.30 mg/g，花11.12 mg/g）相比较低；须根和叶提取物对ABTS+自由基的清除作用较好，清除率分别达到97.98%和96.90%，其总黄酮含量分别达到9.81和12.30 mg/g。射干总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性分析结果显示，射干总黄酮含量与其DPPH自由基的清除能力相关不显著，但与ABTS+自由基的清除能力呈极显著正相关。张玲等[18]研究发现，药桑提取物总黄酮含量与DPPH清除率呈显著正相关，与ABTS+清除率呈不显著正相关。牛东玲等[19]研究发现，宁夏枸杞叶萃取的总黄酮含量在一定质量浓度下对DPPH自由基具有较高的清除率，DPPH自由基清除率与总黄酮含量呈极显著正相关。杨利军[20]研究结果显示，多种中药提取液DPPH抗氧化抑制率与总黄酮含量的相关系数为0.608 8，二者存在一定的相关性，但线性关系不显著。李红梅[21]发现，苦荞茶总黄酮含量与清除DPPH自由基的能力呈极显著负相关，与其总抗氧化能力呈极显著正相关。以上研究为射干的综合开发利用提供了一定的参考。