基于miR145-5p 负反馈调控TGF-β1/Smads 通路抑制巨噬细胞极化的实验研究

王晴晴，谌 曦，万 磊，范海霞，刘天阳，李 明，刘 磊，葛 瑶，范文杰，费陈晨，周 倩

（1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院风湿科，安徽 合肥 230031）

类风湿性关节炎（rheumatiod arthritis，RA）是一种以滑膜关节侵蚀为主要病理基础的慢性疾病，其中巨噬细胞极化几乎贯穿RA 发展及转归的全过程，通过抑制或消除促炎巨噬细胞的发育来重建巨噬细胞平衡将是治疗RA 的有效方法［1］。TGF-β1/Smads 通路已被证明与RA 患者的滑膜增生相关，并被认为是RA 治疗的一个重要靶点［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种可与靶基因结合的非编码的小RNA，在调控巨噬细胞发育、增殖、凋亡中发挥重要作用［3］。RA 患者的血液及滑膜中的miR145-5p 表达异常，可对RA 患者产生不可逆的关节损害［4］。活化的滑膜巨噬细胞在类风湿性关节炎中产生促进慢性炎症的异常调节条件中发挥着重要作用［5］。相关研究证实miR145-5p可能通过靶基因的表达来调控TGF-β1/Smads 通路，对滑膜的炎症程度造成影响［6，7］。本研究通过体外实验培养滑膜巨噬细胞，分析其中miR145-5p 表达水平的差异对TGF-β1/Smads 通路巨噬细胞极化的影响，为RA 的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人AB 血清购自上海素尔生物科技有限公司；酶标仪型号RT-6000 购自雷杜公司；DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司；电热恒温箱型号DNP-9052BS-Ⅲ购自上海三发；人白细胞介素6（IL-6）型 号 JYM0140Hu＆、人 sCD163 型 号JYM2022Hu＆均购自武汉基因美科技有限公司；离心机型号JW3021HR 安徽嘉文公司；PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（反转录试剂盒）购自赛默飞世尔科技公司；引物合成序列购自Sangon Biotech 公司；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（荧光染料）试剂盒购自Roche 公司；荧光定量PCR 仪型号PIKOREAL 96 购自Thermo Scientific公司；低速迷你离心机型号TD5ATD5A 购自湖南赫西仪器装备有限公司；Western 一抗二抗去除液购自Beyotime 公司；转染相关miR145-5p 购自Ambion 公 司；Smad3 蛋 白 购 自abcam 公 司；Smad7 蛋 白购 自Bioworld 公 司；TGF-β1 购 自abcam 公 司；GAPDH 购自Zsbio 公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞与滑膜成纤维细胞培养 取健康成人AB 血清，用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），用洗液（含2% FBS 的PBS）洗涤，悬浮细胞并计数，取对数生长期的人单核细胞（THP-1）以接种于孔板中，加入佛波酯，培养48 h即巨噬细胞，在IFN-γRPMI1640 完全培养基2 mL中24 h 后即可诱导为M1 型巨噬细胞。通过transwell 共培养小室将RA 滑膜成纤维细胞与M1 型巨噬细胞共培养。

1.2.2 细胞培养、分组 滑膜巨噬细胞在DMEM完全基中，进行滑膜巨噬细胞共培养，将共培养细胞分为4 组：RA 组（空白组）、TGF-β1 组（模型组）、TGF-β1+miR145-5p mimics（miR145-5p过表达组）、TGF-β1+miRNA-145-5p mimics-NC（miR145-5p 阴性对照组）。

1.2.3 细胞转染 共培养细胞接种于6 孔板中，LPS 预刺激24 h 后PBS 清洗2 次。空白组不做任何处理，模型组、过表达组、阴性对照组培养基中加入TGF-β1 处理48 h 诱导（终质量浓度为10 ng/mL）。过表达组和阴性对照组在10 ng/mL 的TGF-β1 处理诱导48 h 后，采用Lipofect-mineTM2000 转染试剂说明书进行转染。将miR145-5p mimics 和miRNA-145-5p mimics-NC 转染至共培养细胞，转染后培养6 h，更换含10%AB 血清的低糖DMEM 培养基继续培养24 h，收集各组细胞。

1.2.4 ELISA 法检测滑膜巨噬细胞表达 转染培养24 h 后取细胞培养上清1000g离心20 min，取上清液。采用酶联免疫吸附法（ELISA）IL-6，CD163的浓度，用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD 值）。

1.2.5 qRT-PCR 检 测miR145-5p 与TGF-β1/Samd通路表达 取各组细胞加入Trizol 试剂，提取总RNA，A250/A270 的比值在19～201 用于反转录，参照参考文献利用PCR 试剂盒进行扩增［8］。miR145-5p 以U6 为内参，使用Relative Quantification Study，计 算 方 法 为2-△△Ct。计 算miR145-5p、TGF-β1mRNA 和Smad3mRNA、Smad7mRNA 的相对表达水平。实验用各引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.6 Westernblot 检测Smad 蛋白表达 收取细胞样本（约1×105个细胞）或组织样本（约0.1 g 左右），加入RIPA 细胞裂解液600 μL（内含0.6 mmol/L PMSF）进行裂解。12 000 r/min 离心15 min。参照参考文献方法［9］，分别进行SDS-PAGE 电泳、转膜液、封闭、一抗二抗稀释（一抗稀释比例1∶1 000、二抗稀释比例1∶20 000）、室温孵育。加入洗涤液（PBST）洗膜后，显色来检测蛋白。

1.2.7 Transwell 细胞迁移实验 Transwell 小室培养24 h 后（37 ℃），拭去微孔膜上未穿过小室膜的细胞；室温条件下用4% 多聚甲醛溶液处理细胞20 min，后染色15 min，在光学显微镜随意观察3 个视野穿过Transwell 小室膜的细胞数。

1.2.8 CCK8 实验检测细胞生长情况 转染48 h后，胰酶消化对数期细胞分别接种于96 孔板中，每孔100 μL 细胞悬液，并设置只加培养液不接种细胞的空白对照组和模型组，每组设3 个复孔。在孵育培 养48 h 后（37 ℃，5%CO2），每 孔 加 入10 μL CCK8，继续培养2 h，用酶标仪测定在460 nm 处的吸光度。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS26.0 数据分析软件及GraphPadPrism 7 绘图软件处理数据。计量资料用（±s）表示，相关性分析采用Spearman 分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。组内两两比较采用LSD-t检验，多组间数据的比较采用ANOVA，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1 诱导对滑膜巨噬细胞细胞表达水平的影响及miR145-5p 过表达对滑膜巨噬细胞炎症因子表达的影响

实验结果显示，与空白组相比，TGF-β1 组滑膜MI 型巨噬细胞IL-6 显著升高（P＜0.01），M2 型巨噬 细 胞 分 子CD163 显 著 降 低（P＜0.05），提 示TGF-β1 诱导刺激可加剧炎症反应。与模型组和miR145-5p 过表达阴性对照组相比，miR145-5p mimics 组滑膜巨噬细胞抑炎分子CD163 水平均显著升高（P＜0.01），致炎因子IL-6 显著降低（P＜0.05），提示miR145-5p 过表达可抑制致炎因子表达，促使M1 型巨噬细胞向M2 型巨噬细胞极化。见表2。

表2 TGF-β1 对滑膜巨噬细胞细胞中IL-6和CD163 表达的影响（n=6，±s）Tab 2 Effects of TGF-β1 on the expression of IL-6 and CD163 in synovial macrophages (n=6，±s）

表2 TGF-β1 对滑膜巨噬细胞细胞中IL-6和CD163 表达的影响（n=6，±s）Tab 2 Effects of TGF-β1 on the expression of IL-6 and CD163 in synovial macrophages (n=6，±s）

注：与空白组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组、过表达阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 。

Groups RA 组TGF-β1 组IL-6（ng/mL）16.42±1.31 109.15±17.56▲▲CD163（pg/mL）8 387.08±1 223.47 1 342.53±231.01▲TGF-β1+miR145-5p mimics 组TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 组54.71±5.23*4 205.62±402.77▲▲**106.31±16.38 8 081.49±1 766.91 56.201＜0.05 F P 78.496＜0.001

2.2 miR145-5p 过 表 达 与TGF-β1/Smads 通 路 基因表达关系

PCR 检测结果显示，与模型组和miR145-5p 过表达阴性对照组相比，miR145-5p-mimics 组 能明显上调共培养细胞中miR145-5p 的表达水平，抑制共培养细胞中TGF-β1mRNA 的表达水平，Smad3 mRNA 显 著 降 低，Smad7 mRNA 显 著 升 高（P＜0.01），差 异 具 有 统 计 学 意 义，见 表3。 提 示miR145-5p 过表达可通过抑制TGF-β1、Smad3 的表达，促进Smad7 的表达进而调控TGF-β1/Smads通路。

表3 miR145-5p 过表达对TGF-β1 诱导的Smad 蛋白基因的的影响（n=6，±s）Tab 3 Effects of miR145-5P overexpression on TGF-β 1-induced Smad protein gene（n=6，±s）

表3 miR145-5p 过表达对TGF-β1 诱导的Smad 蛋白基因的的影响（n=6，±s）Tab 3 Effects of miR145-5P overexpression on TGF-β 1-induced Smad protein gene（n=6，±s）

注：与模型组、miR145-5p 过表达阴性对照组相比，▲▲P＜0.01，**P＜0.01 。

Groups RA 组TGF-β1 组TGF-β1+miR145-5p mimics 组TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 组miR145-5p 1.02±0.60 0.61±0.80 4.20±0.61▲▲**1.09±0.97 51.920＜0.001 FP Smad3 1.03±0.49 2.43±1.45 1.79±0.39▲▲**2.32±0.14 50.505＜0.001 Smad7 1.00±0.23 0.49±0.46 0.75±0.51▲▲**0.53±0.72 127.288＜0.001 TGF-β1 0.99±1.06 3.07±0.26 2.20±0.74▲▲**3.00±0.21 34.371＜0.001

2.3 miR145-5p 过表达对滑膜巨噬细胞相关蛋白的影响

Western blot 实验结果显示，4 组的标志蛋白条带表达水平比较差异显著，见图1。miR145-5p 过表达组Smad7 蛋白显著高于模型组和miR145-5p 过表达阴性对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表4。提示miR145-5p mimics 在滑膜巨噬细胞中可抑制TGF-β1、Smad3 蛋白的表达，增加Smad7 蛋白的表达。

表4 滑膜巨噬细胞中TGF-β1/Smads 通路蛋白表达情况（n=6，±s）Tab 4 Expression of TGF-β1/Smads pathway proteins in synovial macrophages（n=6，±s）

表4 滑膜巨噬细胞中TGF-β1/Smads 通路蛋白表达情况（n=6，±s）Tab 4 Expression of TGF-β1/Smads pathway proteins in synovial macrophages（n=6，±s）

注：与模型组、miR145-5p 过表达阴性对照组相比，▲▲P＜0.01，**P＜0.01 。

TGF-β1 0.32±0.02 0.67±0.10 0.32±0.95▲▲**0.55±0.11 29.75＜0.001 Groups RA 组TGF-β1 组TGF-β1+miR145-5p mimics 组TGF-β1+miR145-5p mimics-NC 组FP Smad3 0.17±0.09 0.63±0.39 0.20±0.50▲▲**0.58±0.45 154.77＜0.001 Smad7 0.86±0.11 0.18±0.98 0.60±0.52▲▲**0.48±0.29 40.31＜0.001

图1 各组滑膜巨噬细胞TGF-β1/Smads 信号通路相关蛋白表达情况Fig 1 Expression of TGF-β1/Smads signaling pathway related proteins in synovial macrophages of each group

2.4 miR145-5p 过表达对RA 滑膜巨噬细胞迁移的影响

CCK-8 检测细胞的迁移能力，transweill 小室显微镜下观察，迁移实验可见miR145-5p 过表达组的穿膜细胞明显少于RA 组、模型组和过表达阴性对照组（P＜0.01），见图2、3。transwell 小室结果表明miR145-5p 过表达明显减少巨噬细胞侵袭，改善炎症反应。

图2 显微镜视野下穿膜细胞图片（×100）Fig 2 Picture of transmembrane cells under microscope（×100）

2.5 miR145-5p 及M1、M2 型 巨 噬 细 胞 标 志 物 与Smads 蛋白表达的相关性分析

Spearman 相关性分析得出，miR145-5p 与Smad3 呈负相关（P＜0.01）、与Smad7 呈正相关（P＜0.01）；M1 型巨噬细胞IL-6 与Smad3 呈正相关（P＜0.01）、与Smad7 呈正相关（P＜0.05），M2 型巨噬细胞分子CD163 与Smad3、Smad7 的相关性同IL-6相反。相关性分析结果表明miR145-5p 可通过抑制Smad3 表达调节巨噬细胞极化，见表5。

表5 miR145-5p 及巨噬细胞标志物及与Smads 蛋白表达的相关性分析Tab 5 Correlation analysis of miR145-5P and macrophage markers and Smads protein expression

图3 显微镜视野下穿膜细胞数目Fig 3 Number of transmembrane cells in microscopic field

3 讨论

RA 是临床常见的、进行性发展的免疫性疾病。越来越多的证据表明，巨噬细胞极化在RA 疾病的发展过程中发挥举足轻重的作用［10］。巨噬细胞分为两个亚群，M1 型巨噬细胞极化后分泌大量促炎性细胞因子、趋化因子等激活成纤维细胞和破骨细胞，引发一系列炎症反应，造成关节软骨破坏，M2型巨噬细胞表面表达拮抗致炎分子促进组织修复和减轻炎症反应［11，12］。相关研究发现［13，14］，在RA 患者和小鼠模型血液和滑膜组织中，巨噬细胞与M1和M2 标记物不平衡存在于细胞的表面，滑膜中M1/M2 比值增加，促进了破骨细胞的形成，并增强免疫应答。因此干预巨噬细胞M1 型向M2 型转变，使M1/M2 恢复动态平衡状态，有利于促进RA 滑膜炎症的修复。

转化生长因子-β（TGF-β）为多效能生长因子，可刺激细胞外基质的分泌与沉积，在诱导细胞凋亡、骨的形成、调节血细胞生成及免疫应答等风湿免疫疾病方面起着重要的调节作用。Sun 等［15］发现TGF-β1 在RA 患者滑膜巨噬细胞的高表达具有特异性，TGF-β1 在滑膜巨噬细胞的高表达可促进RA患者中M1 型致炎因子表达，从而促进其发生炎症反，导致RA 患者病情的复发和发展。Zhu 等［16］研究证实TGF-β1 在RA 患者的成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）和滑膜液中表达较高，TGF -β1 增强RA 的迁移和侵袭。本次实验，采用TGF-β1 诱导刺激滑膜巨噬细胞，以未经TGF-β1 诱导刺激的滑膜巨噬细胞作为对照，ELISA 法检测结果显示，模型组M1型巨噬细胞IL-6 分泌水平升高，M2 型巨噬细胞分子CD163 分泌水平降低，说明TGF-β1 刺激可加剧了滑膜巨噬细胞炎症反应，这也与之前的相关研究结果相符。

TGF-β1 通过募集炎性因子、细胞增殖等形式作用于巨噬细胞及免疫细胞等，使下游Smads 蛋白家族活化，TGF-β1/Smads 通路已被证明是改善RA滑膜增生的一个重要靶点［17］。SMAD 蛋白是TGFβ 细胞内信号传导重要下游通路，经TGF-β 受体-Ⅰ磷酸化（TβRI）后，与受体调节型蛋白SMAD3 形成异构体复合物，磷酸化并激活下游的Smad3 诱导向间充质上质转化，促进RA 病理。Smad3 基因多态性可能导致TGF/Smad 信号通路的干扰，而该信号通路通过多重机制影响T 细胞的反应和基因表达［18］，这可能导致抑制反式生长因子（TGF）-β 介诱导Treg 细胞，以及诱导Th1 和Th17 的发育。Smad7 是抑制型蛋白而，Smad7 能引起TβRI 降解，从而阻断Smad3 磷酸化，抑制TGF-β1 传导，阻止炎症对关节持续造成损伤，延缓RA 疾病进展。Smad7 缺失可能刺激Th 细胞分化和自身抗体的产生，从而促进自身免疫性关节炎进展，增强NF-κB激活、Th1/Th17 分化和滑膜炎症［19］。因此，降低Smad3 蛋白表达、增加Smad7 蛋白表达可能是延缓RA 关节滑膜炎症的关键步骤。

miRNA 可通过与靶基因的互补配对，在转录后调节基因表达进而调控调控下游Smad 蛋白的表达，在RA 发展机制中发挥重要作用。miR145-5p 作为miRNA 家族成员之一，近年来研究miR145-5p 表达对RA 的影响愈加深入。明建松等［20］成功建立胶原诱导的小鼠模型，发现miR145-5p 抑制了CIA 小鼠 的 关 节 炎 症。 Qiu 等［21］通 过 慢 病 毒 介 导 的miR145 过表达分离和敲除重组病毒，发现miR145增强了TGF-β/Smad 通路，导致星状细胞的激活。本研究PCR 结果显示miR145-5p 过表达组相比其他三组而言，miR145-5p mRNA 表达明显升高，Smad3mRNA 表 达 明 显 降 低，Smad7mRNA 表 达 明显升高。ELISA 结果显示miR145-5p 过表达组抑制M2 型巨噬细胞向M1 型巨噬细胞极化，降低降低M1 型致炎因子表达，增加M2 型抑炎因子表达；transwell 小室结果显示miR145-5p 过表达明显减少巨噬细胞侵袭。以上证据都表明miR145-5p 过表达能调节巨噬细胞极化平衡。

Paradowska 等［22］基 于ROC 分 析，认 为Smad3可能是类风湿性关节炎临床实验和诊断的重要生物标志物。Yu 等［23］利用双荧光素酶报告基因分析，Smad3、TGF-β1 炎症通路的关键元素是miR145 的靶 点。Yu 等［24］利 用 在 线 预 测 法 证 实Smad3 是miR145 与3‘-UTR 结 合 的 直 接 靶 基 因，过 表 达miR145 显著抑制了Smad3mRNA 和蛋白的表达，部分地抑制破骨细胞分化。此次实验通过WB 对RA 患 者TGF-β1/Smads 通 路 相 关 蛋 白 表 达 水 平 进行分析，结果发现miR145-5p 过表达组Smad3 降低，Smad7 升 高，M1 型 致 炎 因 子 表 达 下 降，M2 型 抑 炎因子表达升高。同时相关性分析显示miR145-5p 与Smad3 呈负相关，M1、M2 型巨噬细胞极化标志物与Smad3、Smad7 相关性也和PCR、WB 结果相佐证。

综上所述，本研究得到以下结论：miR145-5p 过表达可能通过负反馈调控Smad3 蛋白，抑制TGF-β 1/Smads 通路炎症因子的表达，抑制M2 型巨噬细胞向M1 型转变，从而维持巨噬细胞极化动态平衡，可能是RA 的临床实验和治疗新的靶点。

作者贡献度说明：

王晴晴：进行细胞试验、记录分析数据、撰写论文；谌曦：设计试验，并对论文提出指导意见；万磊、范海霞、刘天阳、李明、刘磊、葛瑶：参与实验内容及收集数据；范文杰、费陈晨、周倩：标本采集。

所有作者声明无利益冲突。