Caveolin-1调控VEGFR-2对肺癌细胞增殖及侵袭的影响

崔玉洁,杜梦颖,李 硕，李义帅，刘苗苗，张洪珍

(1. 河北省人民医院,河北 石家庄 050000；2. 河北省胸科医院,河北 石家庄 050000)

肺癌的发病率和病死率在全球范围内一直位居前位，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的85%以上[1]。手术、放化疗、靶向、免疫等多手段联合治疗已成为提高恶性肿瘤疗效的重要手段，其中抗血管生成靶向治疗是目前的研究热点之一。血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)与其配体血管内皮生长因子(VEGF)结合后导致酪氨酸激酶域激活，引起下游多条信号通路的活化，而血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR-TKIs)可竞争性抑制ATP与VEGFR-2激酶域结合，切断下游信号通路的传导，通过强效抑制肿瘤血管生成发挥抗肿瘤作用[2]。多中心的临床研究表明，VEGFR-TKIs如阿帕替尼、安罗替尼等可以改善晚期肺癌患者预后，使其生存显著获益，但临床疗效却不尽相同，且最终都会发生耐药，从而导致预后不良[3-4]，这提示可能存在影响VEGFR-2表达及其与VEGFR-TKIs相互作用的因素。小凹蛋白(Caveolin-1，Cav-1)是细胞质膜表面特异性膜内陷囊泡的重要标志性结构，可以和许多蛋白分子结合调控下游的信号通路，进而影响细胞的增殖、黏附、迁移等。目前研究认为Cav-1与肿瘤的发生发展密切相关，与肿瘤细胞的多药耐药及药物敏感性有关[5]。本研究旨在探讨Cav-1通过调控VEGFR-2影响肺癌细胞增殖及侵袭的分子机制，为预测肺癌抗血管生成药物疗效提供新的生物标记物。

1 实验材料与方法

1.1材料与试剂 人肺腺癌H1299细胞，中国科学院上海细胞库；胎牛血清及RPMI 1640培养基，美国Gibco公司；Cav-1 shRNA及阴性对照质粒，美国Santa Cruz公司；转染试剂，美国Invitrogen公司；Transwell小室，美国Corning公司；Matrigel基质胶，美国BD公司；兔抗p-VEGFR2、VEGFR2、p-Akt、Akt、p-Erk、Erk和鼠抗β-actin一抗、抗鼠及抗兔的二抗，美国Cell Signaling公司；酶标仪及CO2培养箱，美国Thermo公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；电泳槽，北京市六一仪器厂。

1.2细胞培养与质粒转染 人肺腺癌H1299细胞在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的完全1 640培养基中复苏，置于无菌培养箱(37 ℃、5%CO2)培养。选取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，将所接种的细胞分别设置为H1299组(亲本株)、H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组。分别将阴性对照质粒和Cav-1 shRNA质粒与转染试剂按比例混合，对H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组细胞进行转染，梯度嘌呤霉素进行抗性筛选。H1299组细胞在第5天全部死亡，将H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组筛选出的稳定转染细胞扩大培养，分别作为H1299/Ctrl细胞和H1299/Cav-1 shRNA细胞用于后续实验。

1.3稳转细胞系中Cav-1蛋白表达Western blot检测 收集并裂解处于对数生长期的H1299、H1299/Ctrl和H1299/Cav-1 shRNA细胞，提取蛋白并定量分析，制胶电泳并转膜，以β-actin为内参，分别用一抗Cav-1(1∶5 000)、β-actin(1∶2 000)4℃冰箱孵育过夜，相应二抗(1∶5000)室温孵育1h，暗室进行曝光，使用Image J软件扫描条带灰度值。

1.4细胞增殖MTS检测 实验设置H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组。将处于对数生长期的H1299/Ctrl和H1299/Cav-1 shRNA细胞消化后离心计数，5 000个/孔接种于96孔板，无胎牛血清的1 640培养基饥饿4 h，每组再分为不加VEGF组和加VEGF组(加入VEGF 50 ng/mL)，培养24 h后加入MTT(20 μL/孔)，测定各孔吸光度(OD)值，检测细胞的增殖能力。

1.5细胞迁移平板划痕检测 实验设置H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组。将处于对数生长期的H1299/Ctrl和H1299/Cav-1 shRNA细胞消化后铺于24孔板，待细胞融合度达70%，用10 μL 移液器吸头进行细胞划痕，PBS清洗漂浮细胞，显微镜下分别拍摄0 h、24 h划痕宽度，利用E尺分析：迁移率=(划痕初始宽度-划痕目前宽度)/2/划痕初始宽度×100%。

1.6细胞侵袭Transwell检测 实验设置H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组。将1∶6配制的Matrigel基质胶轻铺入Transwell小室，置于4 ℃冰箱过夜。将对数生长期的H1299/Ctrl和H1299/Cav-1 shRNA细胞消化计数(1×106个/mL，200 μL/孔)铺于上室，分别加入VEGF(50 ng/mL),下室加入600 μL含高浓度血清的1 640培养基，24 h后用预冷的95%乙醇进行细胞固定，常规HE染色，显微镜(200×)下计数穿膜细胞数。

1.7相关通路蛋白表达Western blot检测 实验设置H1299/Ctrl组和H1299/Cav-1 shRNA组,收集细胞前10 min将每组再分为不加VEGF组和加VEGF组(加入VEGF 50 ng/mL)。收集并裂解处于对数生长期的H1299/Ctrl和H1299/Cav-1 shRNA细胞，提取总蛋白并定量分析，制胶电泳并转膜，以β-actin为内参，分别用一抗p-VEGFR2(1∶2 000)、p-Akt(1∶3 000)、p-Erk(1∶3 000)、VEGFR2(1∶2 000)、Akt(1∶4 000)、Erk:(1∶4 000)、Cav-1(1∶5 000)、β-actin(1∶2 000)4 ℃冰箱孵育过夜，相应二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，暗室进行曝光，使用Image J软件扫描条带灰度值。

2 结 果

2.1肺癌H1299细胞中Cav-1蛋白表达情况H1299组、H1299/Ctrl组、H1299/Cav-1 shRNA组细胞中Cav-1蛋白相对表达量分别为1.08±0.10，1.16±0.03，0.25±0.02，H1299/Cav-1 shRNA组细胞中Cav-1蛋白相对表达量明显低于H1299组和H1299/Ctrl组(P均<0.05)。见图1。

图1 各组肺癌H1299细胞系中Cav-1表达情况

2.2肺癌H1299细胞增殖情况 加或不加VEGF刺激，H1299/Cav-1 shRNA组细胞的OD值均明显低于H1299/Ctrl组(P均<0.05)。见图2。

图2 稳定转染各组肺癌H1299细胞增殖能力

2.3肺癌H1299细胞迁移能力 H1299/Cav-1 shRNA组细胞的迁移率为(13.33±3.33)%，明显低于H1299/Ctrl组的(35.02±2.89)%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 显微镜下稳定转染各组肺癌H1299细胞迁移情况

2.4肺癌H1299细胞侵袭能力 H1299/Cav-1shRNA组的穿膜细胞数为(56.67±6.19)个，明显少于H1299/Ctrl组的(157.67±14.73)个，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 稳定转染各组肺癌H1299细胞侵袭情况(HE染色，×200)

2.5肺癌细胞中相关通路蛋白表达情况 在VEGF刺激下，H1299/Cav-1 shRNA组细胞中p-VEGFR2、p-Akt、p-Erk蛋白相对表达量均明显低于H1299/Ctrl组(P均<0.05)，2组细胞中VEGFR2、Akt、Erk蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图5及表1。

图5 稳定转染各组肺癌H1299细胞中各蛋白表达情况

表1 VEGF刺激时稳定转染各组肺癌H1299细胞中各蛋白相对表达量比较

3 讨 论

目前我国自主研发上市的VEGFR-TKIs药物阿帕替尼、安罗替尼等，无论其单药或与化疗、靶向或免疫药物联用均可使晚期肺癌患者获益[6-7]。但随着VEGFR-TKIs药物的广泛应用，相继出现了如下问题：①不同癌肿之间、相同癌肿不同个体之间的疗效存在差别，无可靠的生物标志物用于预测临床疗效；②部分患者在治疗后延长了无进展生存期，但随后出现耐药。因此发掘调控或逆转耐药的分子机制势在必行。

Cav-1与肿瘤的发生发展呈正相关，其可通过参与TGF-β1信号途径，增强头颈部鳞状细胞癌的侵袭转移能力[8]。在肝癌细胞中，Cav-1不仅可以通过Wnt/β-catenin途径促进肝癌细胞的进展和转移[9]，还可通过上调核受体4A2/类维生素aX受体α介导的β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶I的表达来促进细胞迁移[10]。Cav-1还可激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路促进乳腺癌的运动、侵袭和转移[11]。Caliceti等[12]证实Cav-1与VEGFR2经常共定位，这种相互作用在肿瘤细胞的存活和增殖中发挥着重要调控作用。本实验结果显示，H1299/Cav-1 shRNA组H1299肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均较H1299/Ctrl组减弱，说明沉默Cav-1的表达减弱了H1299肺腺癌细胞的生物学行为；蛋白表达检测结果显示，VEGF刺激下，H1299/Cav-1 shRNA组p-VEGFR2蛋白表达量明显低于H1299/Ctrl组，而2组VEGFR2蛋白表达量无明显差异，因此猜测其中的分子机制可能是Cav-1通过调控VEGFR2的磷酸化水平，进而影响下游MAPK/Erk及PI3K/Akt信号通路的活化，调控细胞的增殖、迁移、侵袭等一系列生物学行为。

Cav-1还参与调控肿瘤细胞的多药耐药以及药物敏感性环节，且在许多耐药的肿瘤细胞中发现Cav-1高表达[13-14]。在紫杉醇耐药的A549细胞中，沉默Cav-1可以通过增加Bax和减少Bcl-2来诱导细胞凋亡，从而使细胞对紫杉醇敏感[15]。笔者既往的研究也证实，在EGFR敏感突变的PC-9肺腺癌细胞中，敲低Cav-1的表达可以下调EGFR的活化水平，使细胞对吉非替尼和厄洛替尼更加敏感[16]。VEGFR-TKIs药物作用机制明确，但在临床应用过程中，一些患者对其不敏感或先敏感后耐药，说明有些特殊的蛋白影响了VEGFR-2的磷酸化和(或)VEGFR-TKIs与VEGFR-2相互结合。本实验结果提示，Cav-1可能通过调控VEGFR-2的磷酸化进而影响VEGFR-TKIs药物的敏感性，但具体的机制有待进一步研究证实。

综上所述，Cav-1可通过调控VEGFR-2的磷酸化水平影响肺癌细胞的增殖及侵袭，为预测肺癌抗血管生成药物疗效提供了新的生物标记物。后续需要进一步构建过表达Cav-1的细胞株进行正反论证以及药物干预和动物实验等整体研究，以为肺癌的治疗提供更有利的理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。