猫眼草提取物通过miR-30a-5p/NF-κB抑制白介素-1β诱导结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

吴雄健，朱海燕，胡 滢，黄子倩，刘晓平

(赣南医学院第一附属医院 1.消化内科、2.药学部、3.普外五科，江西 赣州 341000)

炎症目前被认为是恶性肿瘤的诊断和评估治疗方案效果的重要标志，在肿瘤的起始、进展、转移和抗肿瘤治疗的抵抗等不同阶段起决定性作用[1]。多种肿瘤相关炎症细胞会增加各种炎症产物在癌变部位的释放和积累，这些产物反馈性地激活肿瘤相关信号级联反应，如信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, Stat3)、核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)和p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)，它们介导大量炎症细胞的募集和促炎因子的分泌，促进及加速肿瘤细胞增殖[2]。结直肠癌(colorectal cancer, CC)是一种与局部慢性炎症广泛相关的疾病[3]。尽管手术及术后辅助放化疗在治疗结直肠癌方面取得了明显的改善，但肿瘤发病机制较复杂导致的耐药性给治疗带来较大的障碍，寻找新的治疗靶点是治疗结直肠癌乃至所有存在耐药性的恶性肿瘤的一个重要的研究方向。靶向炎症对于结直肠癌的防治来说是一种有吸引力的潜在策略。人们逐渐将研究方向转至中药，已有大量的中药或中药提取物被确认具有确切的抗炎抗肿瘤的效果[4]。

猫眼草是大戟科大戟属猫眼草(EuphorbiaesulaL.)的全草，因含有内酯、萜类、黄酮类、类固醇、苯丙烷、酚类和其他化学成分，广泛用于治疗痰、咳、喘、水肿、疥癣等[5]。现代药理研究表明，猫眼草具有多种活性，如抗肿瘤、抗菌和抗氧化活性[6]。大量研究已经证实，猫眼草提取物具有较高的抗肿瘤活性，但较少研究评估猫眼草在结直肠癌中炎症相关的抗肿瘤作用。miR-30a-5p表达上调可抑制结直肠癌细胞的活力和侵袭，miR-30a-5p在增强结直肠癌耐药细胞对化疗药5-氟尿嘧啶的敏感性具有重要意义。报道显示，中药内酯及萜类成分可通过调节miR-30a-5p表达导致结直肠癌细胞的化疗耐药性，含有内酯成分的猫眼草但miR-30a-5p是否可作为猫眼草治疗结直肠癌的潜在靶点尚未可知。因此，本研究建立了结直肠癌的白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)炎症模型，检查猫眼草对结直肠癌的影响并探索了潜在的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料结直肠癌细胞HT29(美国ATCC，货号HTB-38)，miR-30a-5p mimic、mimic对照(miR-NC)、miR-30a-5p inhibitor(anti-miR-30a-5p)、inhibitor对照(anti-miR-NC)(上海吉玛)，细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo，货号CK04)，兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗体 (货号ab16663)、兔抗人基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)2抗体(货号ab92536)、兔抗人MMP9抗体(货号ab76003)、兔抗人磷酸化p65(phospho-p65，p-p65)抗体(货号ab 83559)(美国Abcam)，RIPA裂解缓冲液(北京阳光，货号C190419)。猫眼草药材(亳州中药饮片厂)以1 ∶14的比例加入50%乙醇，回流提取1 h，重复2次。合并2次滤液，浓缩并干燥，即得猫眼草提取物。将猫眼草提取物以培养基稀释成2.5、5和10 mg·L-1的浓度备用。

1.2 细胞培养与IL-1β损伤结直肠癌细胞HT29在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长，培养箱饱和湿润、含95%空气、5% CO2，温度为37 ℃。由预实验和文献[7]得出，100 μg·L-1IL-1β作用结直肠癌细胞HT29 24 h，以诱导IL-1β损伤。

1.3 实验分组将对数生长期的结直肠癌细胞HT29分为：NC组(对照)、IL-1β组(IL-1β损伤)、低剂量(2.5 mg·L-1猫眼草提取物)+IL-1β组、中剂量(5 mg·L-1猫眼草提取物)+IL-1β组、高剂量(10 mg·L-1猫眼草提取物)+IL-1β组、miR-NC(转染miR-NC)+IL-1β组、miR-30a-5p(转染miR-30a-5p mimic)+IL-1β组、anti-miR-NC(转染anti-miR-NC)+高剂量+IL-1β组、anti-miR-30a-5p(转染miR-30a-5p inhibitor)+高剂量+IL-1β组。转染时，结直肠癌细胞HT29以5×105/孔的密度接种在6孔板中并培养至50%～60%的汇合度，然后使用Lipofectamine 2000进行miR-NC、miR-30a-5p mimic、anti-miR-NC、miR-30a-5p inhibitor转染。8 h后根据分组进行IL-1β损伤或/和10 mg·L-1猫眼草提取物处理。其中，猫眼草提取物作用时间为48 h。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖活性将细胞以5×103/孔的密度接种在96孔板中，并在d 2测量细胞增殖活性。每孔加入CCK-8试剂(10 μL)，37 ℃持续2 h。使用Bio-Rad酶标仪测量450 nm处的吸光度A值，细胞的增殖活性表示为A值。

1.5 克隆形成实验检测细胞克隆将不同组别结直肠癌细胞HT29(500个)接种到6孔板中并培养15 d。然后用甲醇固定细胞并用0.5%结晶紫染色30 min。在光学显微镜下计数超过50个细胞的克隆数。

1.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭结直肠癌细胞HT29经不同处理后，将溶于无血清培养基的1×105个细胞铺在24孔、8 μm Transwell板上室(侵袭测定时每孔加入40 μg Matrigel并在37 ℃下保持1 h)，下室加入500 μL含血清培养基进行迁移测定。48 h后，通过包被膜迁移(或侵袭)到下室的结直肠癌细胞HT29用甲醇固定，用1%结晶紫染色，并通过显微镜对每个膜的3个视野进行计数获得迁移和侵袭数量。

1.7 Western blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65蛋白表达水平结直肠癌细胞HT29经不同处理后，使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，使用10% SDS-PAGE分离不同分子量的蛋白(30 μg/泳道)，然后将蛋白转移到PVDF膜上。将膜与5%脱脂牛奶在室温下孵育2 h，与CyclinD1、MMP2、MMP9、β-actin抗体(稀释度均为1 ∶1 000)在4 ℃下过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗在37 ℃下孵育1 h，在凝胶成像系统上用增强型化学发光试剂检测蛋白信号。同法测定NC组、IL-1β组、高剂量+IL-1β组、anti-miR-NC+高剂量+IL-1β组、anti-miR-30a-5p+高剂量+IL-1β组p-p65蛋白的表达水平，p-p65抗体稀释度为1 ∶1 000。

1.8 qRT-PCR检测miR-30a-5p表达水平采用TRIzol法提取结直肠癌细胞HT29总RNA，使用Nano-100微型分光光度计测量RNA浓度，收集A260/A280比为1.8～2.0的样品进行逆转录。按照Taqman MicroRNA Reverse Transcription试剂盒中规定的说明，将RNA逆转录为cDNA。根据Taqman Universal Master Mix II试剂盒的手册，在ABI 7500实时PCR系统进行PCR反应，测定miR-30a-5p的表达。U6作为miR-30a-5p的内参。通过比较CT值法(即2-△△CT法)对miR-30a-5p基因的相对表达进行归一化。引物序列(5′-3′)：miR-30a-5p F: ACTCAGCTGGTGTAAACATCCTCGAC，R:TGGTGTC GTGGAGTCG，U6 F: CGCTTCGGCAGCACATATACT A，R: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

Fig 1 Cell clone formation experiment

2 结果

2.1 不同浓度猫眼草提取物对IL-1β诱导的结直肠癌细胞HT29增殖活性、迁移和侵袭的抑制作用与NC组比较，IL-1β组结直肠癌细胞HT29的增殖活性升高，细胞克隆数增多，细胞迁移和侵袭数量增多(均P<0.01)。与IL-1β组比较，低剂量+IL-1β组、中剂量+IL-1β组、高剂量+IL-1β组结直肠癌细胞HT29的增殖活性降低，细胞克隆数减少，细胞迁移和侵袭数量降低(均P<0.01)。见Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 cells induced by IL-1β n=9)

2.2 不同浓度猫眼草提取物对CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平的影响IL-1β组结直肠癌细胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比NC组升高(均P<0.01)。低剂量+IL-1β组、中剂量+IL-1β组、高剂量+IL-1β组结直肠癌细胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比IL-1β组降低(均P<0.01)。见Tab 2、Fig 2。

2.3 不同浓度猫眼草提取物对miR-30a-5p基因表达水平的影响IL-1β组结直肠癌细胞HT29中miR-30a-5p表达水平低于NC组(P<0.01)。低剂量+IL-1β组、中剂量+IL-1β组、高剂量+IL-1β组结直肠癌细胞HT29中miR-30a-5p表达水平高于IL-1β组(均P<0.01)。见Tab 3。

Fig 2 Expression of cyclinD1, MMP2 and MMP9 detected by Western blot

Tab 2 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on expression of CyclinD1,

##P<0.01**P<0.01vsNC；#P<0.01vsIL-1β

Tab 3 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulataBge extract on expression of miR-30a-5p gene n=9)

2.4 miR-30a-5p对IL-1β诱导的结直肠癌细胞HT29增殖、迁移、侵袭的影响miR-30a-5p+IL-1β组结直肠癌细胞HT29的miR-30a-5p表达水平比miR-NC+IL-1β组增加约1.05倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平、增殖活性、细胞克隆数、迁移和侵袭数量却比miR-NC+IL-1β组降低(均P<0.01)。见Tab 4、Fig 3。

Tab 4 Effects of miR-30a-5p on IL-1β-induced proliferation, migration, invasion and apoptosis of HT29 n=9)

Tab 5 Anti-miR-30a-5p reversed effects of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 induced by n=9)

Fig 3 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

2.5 anti-miR-30a-5p可以逆转猫眼草提取物对IL-1β诱导的结直肠癌细胞HT29增殖、迁移、侵袭的影响anti-miR-30a-5p+高剂量+IL-1β组结直肠癌细胞HT29的miR-30a-5p表达水平比anti-miR-NC+高剂量+IL-1β组减少约0.55倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平、增殖活性、细胞克隆数、迁移和侵袭数量比anti-miR-NC+高剂量+IL-1β组升高(均P<0.01)。见Tab 5、Fig 4。

2.6 NF-κB信号通路蛋白表达情况结直肠癌细胞HT29内NF-κB信号通路蛋白p-p65表达水平在IL-1β组中高于NC组；在高剂量+IL-1β组中低于IL-1β组；且p-p65表达水平在anti-miR-30a-5p+高剂量+IL-1β组中高于anti-miR-NC+高剂量+IL-1β组(均P<0.01)。见Tab 6、Fig 5。

3 讨论

IL-1β是IL-1细胞因子家族的成员。多项研究已确定，IL-1β在肿瘤发生发展中的重要地位，IL-1β具有多效性，通常通过作用于癌细胞增殖和侵袭、新血管生成或肿瘤浸润性免疫细胞而成为癌症的启动子[8]。IL-1β表达上调与结直肠癌患者的不良生存相关[9]。在结直肠癌中，IL-1β通过增加锌指绑定增强蛋白1的表达来诱导细胞迁移和上皮-间质转化[10]。本研究中，IL-1β可诱导结直肠癌细胞HT29增殖、迁移和侵袭能力的增加，表明了IL-1β对结直肠癌的致癌作用，与前述报告吻合。

Fig 4 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

Fig 5 Expression level of p-p65 protein detected by Western blot

Tab 6 Expression level of p-p65 protein detected by

研究表明，猫眼草提取物通过时间和浓度依赖性方式抑制人肝癌HepG2细胞的增殖[11]。猫眼草的乙酸乙酯提取物可以抑制ZR-75-30乳腺癌细胞的生长，其中抑制率随着药物浓度的增加而增加[12]。我们当前的分析旨在确定猫眼草提取物对IL-1β诱导的结直肠癌发生和转移的影响。细胞增殖失调是癌症的标志之一，异常持续的活跃增殖信号传导是人类肿瘤(包括结直肠癌)发展过程中经常发生的事件。本研究中，我们证明猫眼草提取物可降低IL-1β诱导的结直肠癌细胞增殖活性、克隆形成能力，并下调增殖相关蛋白CyclinD1水平。结直肠癌患者预后差和死亡率高是结直肠癌细胞高度恶性的结果[13]。因此，抑制癌症转移可能是改善结直肠癌患者预后的关键。在此，我们的结果表明，猫眼草提取物显著抑制了IL-1β诱导的结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，并下调MMP2、MMP9表达。本研究初步表明，猫眼草提取物可以抑制IL-1β诱导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，因此，猫眼草提取物能抑制结直肠癌中IL-1β的炎症性致癌作用，表现出显著的抗肿瘤活性。

研究表明，与正常对照相比，结直肠癌患者的血清miR-30a-5p水平下调，能降低结直肠癌细胞的增殖和迁移[14]。miR-30a-5p上调可以抑制卵巢癌上皮间质转化和侵袭[15]。表明miR-30a-5p可能是治疗结直肠癌等肿瘤的有希望的靶点。与这些报道类似，本研究发现miR-30a-5p的过表达可以抑制IL-1β诱导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。此外，根据报道，姜黄醇处理可增加miR-30a-5p的表达并激活Hippo信号通路，进而抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移[16]。本研究调查了猫眼草提取物对IL-1β诱导的结直肠癌细胞中miR-30a-5p表达的潜在影响。结果发现，猫眼草提取物增加了IL-1β诱导的结直肠癌细胞中miR-30a-5p的表达。而anti-miR-30a-5p可以逆转猫眼草提取物对IL-1β诱导的结直肠癌细胞HT29增殖、迁移、侵袭的影响。提示猫眼草提取物抑制IL-1β诱导的结直肠癌细胞生长和转移的功能与上调miR-30a-5p有关。

NF-κB是一种已知参与调节癌症发展的转录因子，尤其是肿瘤侵袭和转移[17]。肿瘤中NF-κB的激活驱动肿瘤细胞增殖、存活和侵袭。此外，NF-κB的激活主要是由肿瘤微环境中的炎性细胞因子(如IL-1、TNF-α等)驱动的。根据报道，IL-1β/NF-κB信号通过miR-181a/PTEN轴促进结直肠癌细胞生长[18]。可见IL-1β能激活NF-κB通路，与本研究中IL-1β提高p-p65蛋白表达水平一致，但猫眼草提取物拮抗这种作用。此外，anti-miR-30a-5p逆转了猫眼草提取物对p-p65蛋白表达的抑制作用。可见，猫眼草提取物通过上调miR-30a-5p并抑制NF-κB信号通路活性来抑制IL-1β诱导的结直肠癌细胞生长和转移。

总之，这些结果表明猫眼草提取物通过上调miR-30a-5p、下调NF-κB信号通路活性，来抑制IL-1β诱导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。这些发现提供了对猫眼草提取物在抑制结直肠癌生长中作为炎症反应调节剂的中心功能的新理解，为猫眼草应用于结直肠癌治疗提供了基础。