病毒诱导的基因沉默技术研究进展

康立茹，王 永，杨永峰，高 婧，董 婧，王黎胜，刘 燕*

(1.内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜花卉研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.乌拉特中旗水利局，内蒙古 乌拉特中旗 015300；3.乌海市农业发展中心，内蒙古 乌海 016000;4.呼伦贝尔市农畜产品质量安全中心，内蒙古 呼伦贝尔 021000)

随着许多作物全基因组测序工作的完成，从反向遗传学角度，即根据已知序列克隆相关基因，利用生物技术从基因缺失和基因获得两个互补的方面研究基因的功能，已经成为近年来基因功能研究的主要策略。这一策略的基础大多是要蛋白组或者转录组等高通量测序技术结合生物信息学的分析，首先获得不同时间点、不同植物组织等处理下基因的表达谱，筛选出与处理直接相关的目标基因，再进行功能验证。

1 VIGS 技术的机制及发展

病毒诱导的基因沉默技术 （VIGS,Virus-induced gene silencing）正如字面意思一样，病毒作为异源的核酸，在其侵染植物时，会被植物识别，而后启动一系列的调控机制来降解病毒的RNA。 研究人员根据这一原理，改造病毒载体，使其携带目的基因cDNA 后侵染植物，病毒RNA 在复制过程中会与植物转录后自身的RNA 配对形成杂合的双链RNA（double stranded RNA, dsRNA），植物细胞会识别这种错误的dsRNA，并启动特异性核酸内切酶Dicer 类似物对其进行切割，最终形成21～23 nt 大小的小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）[1]，siRNA、 植物靶基因翻译后形成的单链 RNA、Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）[2]，最终通过特异性降解转录过程中的靶基因的RNA 序列而达到基因沉默的目的，属于转录后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）[3]。

病毒作为VIGS 技术中的重要载体，最早科研人员主要围绕RNA 病毒进行研究，涉及作物主要有本氏烟、 番茄等。 Kumagai MT 用烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）作为侵染载体，使其携带PDS 目标基因cDNA 反义链，侵染烟草后，叶片出现白化。自此以后大量的研究都证明了烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV） 是植物病毒中寄主范围最广的病毒，可以对50 多个双子叶和单子叶植物中的400 多个品种造成侵染，当然很多寄主侵染而不引起症状。TRV 病毒作为VIGS 载体的体系不断探索和建立，Ratcliff F 等[4]证明了TRV 可以用于本氏烟中基因功能研究，可造成系统侵染，且不会造成病毒症状；Liu Y 等[5]利用TRV 病毒载体成功侵染番茄植株，致使番茄中PDS、CTR1 和CTR2 三个基因沉默，同时该病毒还可侵染番茄果实，导致基因沉默[6]；Chung E[7]首次用TRV 侵染辣椒叶片，PDS 沉默后叶片出现光漂白现象，证明了该技术可用于辣椒中基因功能研究；此外该技术同样成功应用在矮牵牛[8]、草莓[9]等作物中。

病毒诱导的基因沉默技术中应用的病毒载体除了烟草脆裂病毒TRV 以外，另外涉及的病毒载体还有很多，如Ruiz MT 等构建带有本氏烟PDS 基因cDNA 序列的马铃薯X 病毒 （potato virus X,PVX）[10]载体，侵染烟草后植株出现光漂白现象，并能造成系统性基因沉默。 Faivre-Rampant O 等[11]研究表明，PVX 可诱导二倍体和四倍体马铃薯中的PDS 基因沉默而使马铃薯叶片出现光漂白的现象，这种现象在多代扩繁的组培苗和微型薯块中都可观察到。此外豌豆早枯病毒（Pea early browning virus，PEBV）[12]、大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV)[13]等VIGS 载体均被研究和应用，突破VIGS 技术因作物种类和病毒类型所限，而被广泛应用于多种作物对相应处理中某个或某些基因功能的研究中。

2 VIGS 技术在植物抗病基因功能研究中的应用

根据目前报道，VIGS 是鉴定植物基因功能的主要工具，应用领域涉及番茄、茄子、棉花、黑麦、小麦等多种植物的抗病基因、代谢和发育相关基因、逆境胁迫，还有花色花香相关基因的研究工作，其中植物抗病基因功能研究是应用最多的领域之一。

黄赛花等[14]利用VIGS 技术对大豆抗大豆花叶病毒（SMV）候选基因Gm Z15 进行功能分析，认为该基因正向调控大豆对SMV 的抗性。 石嵘[15]分析油菜与黑茎病菌互作的转录组数据，得到抗病相关基因WRKY70 和LRR-RLK，并利用VIGS 技术进行了功能验证，认为基因沉默后植株叶片病斑面积变大，褪绿发黄更明显。李雪莹[16]利用TRV-VIGS 技术研究了CmWRKY15-1 基因在菊花抗白色锈病中的功能，证明了CmWRKY15-1 基因沉默后会抑制SA 通路相关基因的表达，也参与SA 合成，从而调控菊花对白色锈病的响应。Zhou X 等[17]将VIGS 技术应用于番茄抗病基因中功能的研究中，沉默掉SlTPR2 和SlTPR4两个基因后，植株更感病。

就VIGS 技术在马铃薯中的应用来讲，相关研究主要有，2001 年Takken 等[18]利用灌根法成功沉默马铃薯PB7 基因，并在接种后20 d 左右观察到症状。2004 年，Faivre-Rampant O 等[19]利 用 马 铃 薯X 病 毒（PVX）作为VIGS 载体，在四倍体和二倍体马铃薯组培苗中成功沉默PDS 基因，白化症状可以在无性繁殖中连续多代存在，并且在微型薯中也可观察到。 随后张晓萝[20]优化了VIGS 技术在马铃薯中的接种方法，并比较了品种差异对VIGS 效率的影响，同时利用该方法证明了StRac 基因在马铃薯抗晚疫病过程中是正向调控因子。 田再民[21]也用VIGS 方法研究马铃薯StRab5b、StRab 两个基因在抗晚疫病中的功能，基因沉默后叶片病斑面积更大。

VIGS 技术在植物与黄萎病互作基因功能研究中的应用也有大量报道，在棉花抗黄萎病相关基因 GhVe1、GbVe1、G hNDR1、Gb CAD1、GhMKK2、GhBAK1、GhEDS1、GhSKIP35 和 GhMLP28、GhB2、GbCRK18 等[22-24]，经过验证有些基因沉默后植株抗性增加，也有些基因沉默后会使植株抗性降低，即基因调控棉花对大丽轮枝菌的抗性呈正负两个方向。当然，相关研究主要集中在棉花这种作物上，关于马铃薯与黄萎病互作基因功能的研究未见报道。