气相色谱-串联质谱法测定生物样品中3种杀鼠剂

2022-12-16 08:20刘云富游慧圆吴燕梅

国际医药卫生导报 2022年23期

刘云富游慧圆吴燕梅

1惠州市职业病防治院理化室，惠州 516008；2惠州市农产品质量安全监督检测中心，惠州 516008

毒鼠强，又名四亚甲基二砜四胺，分子式：C4H8N4O4S2，分子量240.27。毒鼠强是20世纪中期研发的急性杀鼠药，是一种中枢神经兴奋剂，具有强烈的致惊厥作用，对各类动物，包括人类毒性都极高，由于其化学性质非常稳定，在生物体内也不易降解，故容易造成长期的链条性的污染，造成严重的危害［1］。中国已明令禁止生产、使用。氟乙酰胺：俗名敌蚜胺，分子式：C2H4FNO，分子量77.06。氟乙酰胺属高毒鼠药，进入人体后脱胺形成氟乙酸，干扰正常的三羧酸循环，导致三磷酸腺苷合成障碍及氟柠檬酸直接刺激中枢神经系统，引起神经及精神症状。由于其具有高毒性及稳定性，在20世纪90年代国家已明令禁止使用该种鼠药。虽然国家已经明令禁止生产使用毒鼠强、氟乙酰胺，然而因为灭鼠效果好，成本低廉，生产工艺简单，故仍然存在滥用情况［2-3］。在医院的急诊抢救实践中，仍会遇到因误食、服毒自杀或投毒所致的病人。溴敌隆，又名乐万通、溴敌鼠，分子式：C30H23BrO4，分子量527.41。溴敌隆在质谱中会碎裂成另一种物质（为3种同分异构体之一），分子式：C14H11Br，分子量259.14。以溴敌隆为代表的第二代长效抗凝血灭鼠药为我国市面上流行的主流灭鼠药。长效抗凝血灭鼠药主要通过人体消化道摄入引起中毒，主要毒理作用是抑制维生素K依赖性凝血因子的合成，导致凝血障碍［4］。可引起皮肤和脏器出血，中毒后以全身各器官组织的出血为主要表现，例如血尿、鼻衄、颅内出血等，同时伴有凝血指标的异常。由于管理疏漏或使用不当，临床上常见因误食、自杀、投毒等原因导致的该类鼠药中毒患者［5-9］。当前，文献报道对于毒鼠强和氟乙酰胺的同时测定大多采用气相色谱-质谱联用法，对于毒鼠强和溴敌隆的同时测定，采用气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱-质谱联用法，尚未见对于3种杀鼠剂同时测定的报道［10-19］。本实验利用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）同时测定上述种杀鼠剂，方法的检出限低，结果准确可靠，可用于急性化学中毒中，可疑鼠药中毒生物样品中上述3种杀鼠剂的定性定量测定。

材料与方法

2022年5月至6月于惠州市农产品质量安全监督检测中心实验室开展实验。

1、仪器与试剂

1.1、仪器气相色谱-串联质谱仪（三重串联四级杆气相色谱质谱仪，厂家：岛津，型号：GCMS-TQ8040）；VF-1701ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；KQ7200DV超声波清洗器（江苏金怡仪器科技有限公司）；Organomation氮气浓缩仪（N-EVAP®111）；SL-0246漩涡振荡器（美国Scientific Industries公司）；H1650高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；带10µl微量注射器的自动进样器。

1.2、试剂毒鼠强标准品（北京中卫永晟科技有限公司，浓度：200µg/ml）、氟乙酰胺标准品（农业部环境保护科研监测所，浓度：100µg/ml）、溴敌隆标准品（农业部环境保护科研监测所，浓度：100 µg/ml）；氯化钠、无水硫酸钠：分析纯；乙酸乙酯：色谱纯。

2、色谱条件

柱温：初温40.0℃，保持5.0 min，然后以10.0℃/min升到125.0℃，再以20.0℃/min升到270.0℃，保持3.0 min。进样口温度程序：280.0℃，保持时间：10.0 min；以高压进样模式进样，进样压力：250.0 kpa，高压进样时间：1.0 min；载气为氦气，柱流量：1.00 ml/min；不分流进样，进样量：2µl。

3、质谱条件

离子源温度：230℃；接口温度：300℃；EI电压：+0.60 eV；溶剂延迟时间：4.0 min；扫描范围：10～550 amu；SIM离子扫描，毒鼠强：212（定量离子），240，132；氟乙酰胺：44（定量离子），77，60；溴敌隆：258（定量离子），260，178。

4、样品前处理方法

4.1、血样移取2 ml血样于10 ml离心管中，漩涡振荡（2 000 r/min）1 min，离心（14 000 r/min）5 min，离心半径15 mm，血浆/血清全部转移至离心管中，加入2 ml乙酸乙酯和1 g氯化钠，将离心管置于超声仪内进行超声萃取5 min，再离心（14 000 r/min）5 min，取出全部上清液于5 ml具塞刻度锥形玻璃管中，置于40℃氮吹仪中浓缩吹至0.2 ml（或者吹干，然后再加200µl复溶，振摇1 min，静置。若含有水分导致吹不干，需用无水硫酸钠脱水），进样2µl（如果浓缩液浑浊，则要过滤后进样）。

4.2、尿样振摇尿样，静置，取2 ml尿样+1 ml乙酸乙酯+1 ml丙酮+1 g氯化钠于10 ml离心管中，以下前处理步骤同血样处理。

5、混合标准储备溶液的配制

取2 ml容量瓶，先加入少量乙酸乙酯，然后分别加入500 µl毒鼠强标准溶液、200 µl氟乙酰胺标准溶液，500 µl溴敌隆标准溶液，用乙酸乙酯定容至刻度，得到乙酸乙酯中毒鼠强、氟乙酰胺和溴敌隆浓度分别为50µg/ml、10µg/ml、25µg/ml的3种灭鼠剂混合标准贮备液。

结果

1、总离子流色谱图及质谱图

在选定的分析条件下，采用全离子扫描（SCAN）模式对加入乙酸乙酯、血样和尿样中的3种灭鼠剂进行测定，用NIST库对色谱峰进行谱库检索，其总离子流色谱图及质谱图见图1～图6。总离子流色谱图中，氟乙酰胺的色谱峰保留时间为6.216 min，毒鼠强的色谱峰保留时间为20.759 min，溴敌隆色谱峰的保留时间为20.934 min。根据全扫描质谱图选取丰度相对较高的特征离子碎片进行SIM模式检测，选取的离子为：毒鼠强：42，212（定量离子），240；氟乙酰胺：44（定量离子），60，77；溴敌隆：178，258（定量离子），260。

图1 3种灭鼠剂的总离子流色谱图(标准溶液)

图6 溴敌隆的质谱图

2、标准工作曲线与检出限、定量下限

于2 ml血样和尿样中各加入毒鼠强、氟乙酰胺、溴敌隆标准贮备液各16µl、32µl、64µl、128µl、320µl。按样品前处理方法处理后进样测定，以各目标物的定量离子色谱峰峰面积y对其质量浓度x（µg/ml）进行线性回归处理，3种杀鼠剂的检出限和定量下限计算结果见表1。按照职业人群生物监测方法推荐的检出限和定量下限测定方法［20］。以低浓度样品，按实验方法进行分析，以样品信号的3（10）倍标准差（n=7），与低剂量的待测物浓度及其响应值计算所得的待测物浓度，所得浓度即为方法检出限（MDL）、定量下限（MQL），计算公式：

表1 3种灭鼠剂工作曲线、检出限和定量下限

K：样品预处理体积转换倍数；S：测定响应信号的标准差；c：配制的3种杀鼠剂的低剂量浓度；b：c对应的响应信号。

3、方法回收率实验与方法精密度实验

取空白血样和尿样，配制血中毒鼠强浓度分别为0.6µg/ml、1.0µg/ml、4.0µg/ml的混合标准溶液，尿中毒鼠强浓度分别为0.3 µg/ml、0.5 µg/ml、1.5 µg/ml的混合标准溶液，血中氟乙酰胺浓度分别为0.07µg/ml、0.17µg/ml、0.4µg/ml的混合标准溶液，尿中氟乙酰胺浓度分别为0.3 µg/ml、0.5 µg/ml、1.5 µg/ml的混合标准溶液，血和尿中溴敌隆浓度分别为0.3 µg/ml、0.7 µg/ml、3.0 µg/ml的混合标准溶液，同样品处理后，各进行6次平行测定，最后计算每种杀鼠剂的平均回收率和相对，结果见表2。